補(bǔ)腎活血湯對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨修復(fù)的影響

【摘 要】目的：探討補(bǔ)腎活血湯對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨修復(fù)的影響。方法：將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組，即正常組、模型組、補(bǔ)腎活血湯高低劑量組及硫酸氨基葡萄糖陽(yáng)性對(duì)照組，每組8只;采用木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)注射法建立SD大鼠OA模型;末次給藥后取大鼠血清、關(guān)節(jié)炎、軟骨組織;免疫吸附法（ELISA）法檢測(cè)血清及關(guān)節(jié)液中MMP-13，TNF-α及COMP的含量。結(jié)果：將OA模型組與正常對(duì)照組相比較，模型組血清及關(guān)節(jié)液中的炎性因子（MMP-13，TNF-α、COMP）均大幅度增加（P<0.05），與OA模型組相比補(bǔ)腎活血湯高低劑量組大鼠血清及關(guān)節(jié)液中MMP-13，TNF-α及COMP的含量明顯下降（P<0.05）。結(jié)論：六味骨痹湯可促進(jìn)大鼠OA模型軟骨修復(fù)，其機(jī)制可能是通過降低大鼠血清和關(guān)節(jié)液中MMP-13，TNF-α等因子含量抑制軟骨破壞有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】補(bǔ)腎活血湯;骨關(guān)節(jié)炎;軟骨修復(fù);炎癥因子

本實(shí)驗(yàn)通過觀察對(duì)OA模型大鼠灌胃使用臨床常用方劑——補(bǔ)腎活血湯，對(duì)其有關(guān)的炎性因子的抑制水平，從而進(jìn)一步探究其修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的能力及其對(duì)應(yīng)機(jī)制。

1 一般資料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

28天的清潔級(jí)SD大鼠（體重：79±10g），共40只，來源：延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院-實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)為SCXK（吉）2016-007，常溫飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及制備

熟地黃（20g）、菟絲子（20g）、補(bǔ)骨脂（20g）、杜仲（6g）、枸杞子（6g）、肉蓯蓉（6g）、山萸（6g）、獨(dú)活（6g）、沒藥（6g）、當(dāng)歸（6g）、紅花（3g）（均由長(zhǎng)白山保護(hù)開發(fā)中心醫(yī)院藥房提供），將全部藥品使用粉碎機(jī)打碎成粉，使用乙醇水溶液（濃度為75%）進(jìn)行提取，每次2h，反復(fù)進(jìn)行5次，對(duì)提取液進(jìn)行回收，并提取乙醇將其制成凍干粉，使用醫(yī)用生理鹽水將其溶解制成藥液（濃度200mg/mL）。

1.3 藥品及試劑

硫酸氨基葡萄糖膠囊（信東生技股份有限公司）。木瓜蛋白酶（上海鑫樂生物科技有限公司），TNF-α、MMP-3、COMP酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)于Sigma公司（美國(guó)）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

H1650-W型臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)Therom公司）;酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（RT-2100C，美國(guó)）;BK46型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與OA模型制備

將40只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)隨機(jī)分為5組，即正常組、模型組、補(bǔ)腎活血湯高低劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組，每組8只。將OA模型組，補(bǔ)腎活血湯高低劑量組以及陽(yáng)性對(duì)照組小鼠右膝關(guān)節(jié)注射使用木瓜蛋白酶進(jìn)行模型制備。

2.2 治療

參考實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)中人體與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用藥劑量比值對(duì)本次使用的湯劑進(jìn)行相應(yīng)換算，按比例使用生理鹽水對(duì)藥品進(jìn)行稀釋溶解，補(bǔ)腎活血湯高低劑量組劑量分別為1mL/只、0.5mL/只，陽(yáng)性對(duì)照組予藥物1mL/只;不進(jìn)行藥物干預(yù)的正常組與OA模型組按1mL/只的劑量使用生理鹽水進(jìn)行灌胃，為期4周。

2.3 標(biāo)本的制備方法

灌胃結(jié)束后，麻醉全部大鼠，將大鼠于固定板上固定，剪斷其尾部，用一次性注射器采集5ml血液，處死大鼠后對(duì)造模關(guān)節(jié)處實(shí)施剃毛消毒處理，對(duì)其注射生理鹽水（1mL）并充分活動(dòng)關(guān)節(jié)，回收沖洗液（不少于6mL）于1.5mL的Tube管內(nèi)使用4度離心機(jī)離心收集上清液，-80℃冰箱保存。

2.4 細(xì)胞因子的檢測(cè)

使用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)樣本上清液中MMP-13，TNF-α及COMP的含量，其步驟應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒說明書[9]。使用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算炎性因子的含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS17.0軟件進(jìn)行相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理。全部計(jì)量資料以表示，兩組間差異用t檢驗(yàn)，使用單因素方差分析確定多組間比較，當(dāng)P<0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血清及關(guān)節(jié)液中炎性細(xì)胞因子含量

與正常組相比OA模型組血清及關(guān)節(jié)炎中MMP-13，TNF-α及COMP的數(shù)值表達(dá)增高（P<0.05）;與模型中相比經(jīng)藥物治療后的大鼠血清及關(guān)節(jié)炎MMP-13，TNF-α及COMP水平下降（P<0.05）（表1表2）。

4 討論

OA屬于中醫(yī)學(xué)“骨痹”“痹癥”范疇，補(bǔ)腎活血湯出自清代趙竹泉的《傷科大成》，活血通絡(luò)止痛，補(bǔ)調(diào)肝腎，強(qiáng)筋壯骨，可從根本上治療本病[7-9]。本研究是通過觀察補(bǔ)腎活血湯對(duì)大鼠血清及關(guān)節(jié)炎中MMP-13，TNF-α及COMP含量影響，進(jìn)一步評(píng)價(jià)該湯劑對(duì)OA大鼠變態(tài)反應(yīng)的治療效果。

目前OA的發(fā)病機(jī)制尚不明確，多數(shù)研究者認(rèn)為其發(fā)生是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)、軟骨下骨質(zhì)三者降解與合成失衡的結(jié)果[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)多種因子在OA的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，可作為反映關(guān)節(jié)軟骨損傷或修復(fù)的標(biāo)志。其中TNF-α與多種疾病的發(fā)生有關(guān)，免疫性疾病TNF-α水平明顯增高，與膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎病變和軟骨退變密切相關(guān)，它可提高M(jìn)MP-13 的基因表達(dá)，特異性降解Ⅱ型膠原纖維，從而破壞軟骨結(jié)構(gòu)[13]。除此之外，關(guān)節(jié)軟骨受到損傷時(shí)COMP會(huì)從軟骨釋放到關(guān)節(jié)液并吸收入血，故關(guān)節(jié)液及血清中COMP的含量也可反映反映軟骨的破壞程度[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用不同劑量的補(bǔ)腎活血湯干預(yù)后，較模型組相比補(bǔ)腎活血湯組大鼠血清及關(guān)節(jié)液中炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)MMP-13，TNF-α及COMP水平下降，說明補(bǔ)腎活血湯緩解了OA大鼠關(guān)節(jié)的炎性反應(yīng)。故推測(cè)麻黃發(fā)表湯是通過減輕MMP-13，TNF-α及COMP水平，從而達(dá)到治療OA的目的。

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作者簡(jiǎn)介

張?chǎng)危校L(zhǎng)白山保護(hù)開發(fā)中心醫(yī)院副主任醫(yī)師，長(zhǎng)期從事中醫(yī)骨傷方面的研究。