銀杏葉提取物對(duì)1型糖尿病大鼠左心室收縮功能的影響

鄭磊 遲婷婷 王圣凱 胡蘇琴 陳斌 李劍敏

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是由胰島素分泌缺乏或其生物活性受損引起、以高血糖為特征的代謝紊亂性疾病，可引起心血管、腎臟、眼及神經(jīng)的慢性損害[1]。糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）作為DM嚴(yán)重并發(fā)癥，可明顯增加DM患者發(fā)生心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)，已成為DM患者死亡的主要原因之一，但目前臨床尚缺乏有效的防治方法。銀杏葉提取物（extract of Gingko biloba，EGB）是從銀杏葉中提取的傳統(tǒng)中藥，具有抗氧化、抗凋亡、保護(hù)心肌等作用[2-4]，已被用于治療多種心血管疾病[5-6]。本研究應(yīng)用鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）誘導(dǎo)建立1型DM大鼠模型，并用EGB進(jìn)行干預(yù)治療，采用常規(guī)超聲心動(dòng)圖、速度向量成像（velocity vector imaging，VVI）及心導(dǎo)管等檢測(cè)評(píng)價(jià)該方法對(duì)DM大鼠左心室收縮功能的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠 30只，鼠齡 40～50d，體重 180～220g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

1.1.2 儀器和試劑 德國(guó)Simens公司Acuson Sequoia 512C彩色多普勒超聲診斷系統(tǒng)，配備15L8w-S線陣探頭，頻率為12～14MHz；成都泰盟科技有限公司HX-300動(dòng)物呼吸機(jī)。EGB溶液購(gòu)自北京雙鶴高科天然藥物有限公司；STZ、天狼星紅染色試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TUNEL試劑盒購(gòu)自羅氏公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立、分組及干預(yù) 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，禁食不禁水12h后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（CON組）、糖尿病模型組（DM組）和銀杏葉提取物干預(yù)組（EGB組），每組10只。其中后兩組用腹腔注射1%STZ 溶液 65mg/kg（注射前用 0.1mol/L，pH 4.0～4.4 的檸檬酸緩沖液配制）以誘導(dǎo)建立1型DM模型，CON組腹腔給予等體積的檸檬酸緩沖液。分別于注射STZ后第1、3、7天尾靜脈取血測(cè)定血糖濃度，血糖值均穩(wěn)定在16.7mmol/L以上視為造模成功。EGB組參考前期實(shí)驗(yàn)研究[7]，于腹腔注射EGB溶液8mg/（kg·d）進(jìn)行干預(yù)治療，而DM組和CON組則給予等體積的0.9%氯化鈉溶液腹腔注射。所有大鼠自由進(jìn)食、飲水，飼養(yǎng)12周。12周后，測(cè)定各組大鼠血糖和體重。

1.2.2 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)及VVI分析 干預(yù)12周后，各組大鼠用10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉后行常規(guī)超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，測(cè)量各組大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）及左心室短軸縮短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）。隨后啟動(dòng)VVI成像模式，連續(xù)采集3個(gè)心動(dòng)周期乳頭肌水平左心室短軸觀的二維灰階動(dòng)態(tài)圖像，所有動(dòng)態(tài)圖像存入 MO光盤后，導(dǎo)入 Siemens Sygno US Workplace3.01分析軟件進(jìn)行脫機(jī)分析，測(cè)定左心室6個(gè)室壁節(jié)段的收縮期平均峰值速度（Vs）、徑向應(yīng)變（Sr）及徑向應(yīng)變率（SRr），獲得相應(yīng)曲線（圖1）。由2位不同操作者分別進(jìn)行VVI參數(shù)的測(cè)量及數(shù)據(jù)分析進(jìn)行數(shù)據(jù)的重復(fù)性檢驗(yàn)。

1.2.3 心導(dǎo)管檢測(cè) 所有實(shí)驗(yàn)大鼠充分麻醉固定后，切開頸前區(qū)皮膚，分離氣管，接動(dòng)物呼吸機(jī)，打開胸腔，肝素生理鹽水充盈心導(dǎo)管后，將心導(dǎo)管從心尖處直接插入大鼠左心室內(nèi)，經(jīng)過(guò)生物信號(hào)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換后，Chart5 for Windows軟件同步記錄左心室收縮末壓力（left ventricular end-systolic pressure，LVESP）、左心室舒張末壓力（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP） 及左心室內(nèi)壓最大上升/下降速率（the maximal increase/decrease rate of left ventricular pressure，LV±dp/dtmax）[8]。

1.2.4 心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF）測(cè)定 處死大鼠，取出心臟，切取乳頭肌水平左心室心肌組織，用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋后切片，進(jìn)行天狼星紅染色，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。封片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件分析測(cè)量心肌CVF，每組取12張切片，每張切片隨機(jī)取20個(gè)200倍視野，根據(jù)CVF（%）=膠原面積/總面積×100%，取平均值。

1.2.5 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）檢測(cè)取各組大鼠心肌組織切片，按照TUNEL凋亡染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。每組取12張切片，每張切片隨機(jī)取20個(gè)400倍視野，計(jì)算該視野下所有細(xì)胞中染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，AI%=視野內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)×100%。每組取12張切片，每張切片隨機(jī)取20個(gè)400倍視野，取其均值。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性者兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊者進(jìn)行Dunnet’sT3檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 實(shí)驗(yàn)大鼠VVI心肌速度、應(yīng)變、應(yīng)變率曲線（a：速度曲線；b：徑向應(yīng)變曲線；c：徑向應(yīng)變率曲線）

2.1 各組大鼠血糖、體重的比較 干預(yù)12周后，DM組大鼠死亡2只，EGB組大鼠死亡3只。與CON組大鼠相比，DM組及EGB組大鼠血糖明顯增高，體重明顯降低（P＜0.05）；與DM組大鼠相比，EGB組血糖顯著降低，體重明顯增高（P＜0.05），見表 1。

表1 各組大鼠血糖、體重的比較

2.2 各組大鼠常規(guī)超聲心動(dòng)圖及VVI指標(biāo)比較 DM組及 EGB 組大鼠 LVEF、LVFS、Vs、Sr及 SRr均明顯低于CON 組（均P＜0.05），EGB 組 LVEF、LVFS、Vs、Sr及SRr較 DM 組均明顯增高（均P＜0.05），見表2。2位觀察者之間VVI數(shù)據(jù)測(cè)量重復(fù)性良好。

2.3 各組大鼠左心室血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較 EGB干預(yù)12周后，DM組及EGB組大鼠LVESP、+dp/dtmax及-dp/dtmax均明顯低于CON組（均P＜0.05），LVEDP明顯高于 CON 組（P＜0.05），EGB 組 LVESP、+dp/dtmax及-dp/dtmax較DM組均明顯增高（均P＜0.05）；LVEDP明顯減低（P＜0.05），見表 3。

表2 各組大鼠常規(guī)超聲心動(dòng)圖及VVI指標(biāo)比較

表3 各組大鼠左心室血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

2.4 各組大鼠病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較 EGB干預(yù)12周后，天狼星紅染色結(jié)果顯示心肌膠原纖維呈紅色，CVF測(cè)定值顯示DM組及EGB組較CON組明顯增高，EGB組較DM組明顯減低。TUNEL染色顯示凋亡細(xì)胞核呈棕黃色，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色。AI測(cè)定值顯示DM組及EGB組較CON組明顯增高，EGB組較DM組明顯減低。見圖2、3（見插頁(yè)）和表4。

表4 各組大鼠CVF、AI測(cè)定值比較（%）

3 討論

DCM的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制尚未明了，但由DM引起的心肌細(xì)胞凋亡、心肌間質(zhì)纖維化等一系列心肌結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而導(dǎo)致心肌順應(yīng)性降低，心功能異常，被認(rèn)為是DCM發(fā)生、發(fā)展的重要因素[9-10]。因此，減少心肌細(xì)胞凋亡，抑制心肌間質(zhì)纖維化成為防治DCM的關(guān)鍵策略。本研究結(jié)果表明，STZ誘導(dǎo)的1型DM大鼠模型12周時(shí)，CVF及AI測(cè)定值明顯高于CON組，說(shuō)明DM大鼠在12周時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的心肌細(xì)胞凋亡及心肌間質(zhì)纖維化，也是DCM的顯著特征。

EGB是從銀杏葉中提取的活性物質(zhì)，其主要活性成分為黃酮類及萜類內(nèi)酯化合物[3，11]，具有清除自由基、抗氧化的作用，萜類內(nèi)酯化合物具有抑制血小板活化因子及炎癥分泌物的作用，因此，EGB對(duì)DCM的防治具有巨大潛力。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGB組血糖較DM組明顯降低，說(shuō)明EGB具有一定程度調(diào)節(jié)血糖的作用，但是調(diào)節(jié)范圍有限，無(wú)法調(diào)節(jié)至正常水平。

VVI技術(shù)基于斑點(diǎn)追蹤原理，采用超聲像素的空間相干、邊界追蹤等技術(shù)，在二維動(dòng)態(tài)灰階圖像上追蹤感興趣區(qū)內(nèi)的聲學(xué)斑點(diǎn)，自動(dòng)追蹤其運(yùn)動(dòng)，以矢量方式顯示組織運(yùn)動(dòng)的方向、速度及距離等，可全面定量分析心肌組織徑向及周向的運(yùn)動(dòng)，較為準(zhǔn)確地對(duì)整體及局部心肌功能進(jìn)行定量評(píng)估。與傳統(tǒng)的多普勒技術(shù)相比，VVI不受角度的影響，可多切面進(jìn)行分析，不受心臟搏動(dòng)和呼吸的影響，且操作簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)、可重復(fù)性好，因此，在心臟功能定量評(píng)價(jià)方面較常規(guī)超聲及組織多普勒等技術(shù)更有優(yōu)勢(shì)[12-13]。

本研究通過(guò)腹腔注射EGB對(duì)DM大鼠進(jìn)行干預(yù)，并應(yīng)用常規(guī)超聲心動(dòng)圖、VVI及心導(dǎo)管檢測(cè)左心室收縮功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGB組LVEF、LVFS及VVI所測(cè)得的Vs、Sr、SRr等收縮功能指標(biāo)較DM組增高，心導(dǎo)管檢測(cè)左心室血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)也證實(shí)EGB組大鼠左心室收縮功能較DM組明顯改善，同時(shí)，EGB組CVF及AI測(cè)定值明顯低于DM組，說(shuō)明EGB可以減少心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌間質(zhì)纖維化，有效改善DM大鼠左心室收縮功能，有效預(yù)防DCM的發(fā)生。

本研究尚存在一些局限性。首先，DCM的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，EGB是否通過(guò)其他機(jī)制預(yù)防DCM還有待進(jìn)一步研究；其次，干預(yù)12周后，EGB組雖然較DM大鼠心功能有所改善，但仍然出現(xiàn)了心肌病理改變。因此，今后應(yīng)進(jìn)一步深入研究和優(yōu)化給藥劑量、時(shí)間以及是否可以結(jié)合其他藥物共同干預(yù)，取得更滿意的效果。