硫酸右旋糖酐通過影響TGF?β/Smad4信號通路抑制人胃癌細胞的遷移和侵襲

馬艷梅 王瀟飛 王文莙 楊媛媛 徐遠義 黃允寧

1寧夏醫科大學基礎醫學院病理學系（銀川 750004）；2寧夏回族自治區人民醫院胃腸外科（銀川 750001）

隨著醫療技術的進步，胃癌的預后有了很大的改善，但其仍然是世界范圍內最常見的惡性腫瘤，也是導致癌癥死亡的主要原因之一。腹膜轉移是胃癌死亡的主要原因［1］，腹膜轉移的胃癌患者的5年生存率僅為2%［2］。所以能有效抑制胃癌的腹膜轉移對提高胃癌的生存率非常重要。

硫酸右旋糖酐（Dextran Sulfate，DS）是一種大分子硫酸右旋糖酐衍生物，本課題組前期的實驗表明，應用DS可以顯著減少裸鼠胃癌腹膜腔種植轉移瘤結節的數量及體積［3］，也逐步探索了DS抑制胃癌腹膜轉移一些可能的分子機制［4-5］。腫瘤的侵襲、轉移與TGF?β/Smad4信號通路有著密切的關系，本研究將探討DS是否通過影響TGF?β/Smad4信號通路而抑制胃癌的轉移，并為DS抑制胃癌的腹膜種植轉移提供更多的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑胃癌細胞株（MGC?803），由上海華東師范大學生命科學實驗室贈予。RPMI?1640培養基購自Hyclone公司；胎牛血清，購自FUMENG GENE公司；胰蛋白酶?EDTA消化液、青鏈霉素購自北京Leagene生物公司。

1.1.2 藥物DS購自Sigma公司，將DS溶于磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），配制濃度為0.3%，用22 μm的過濾器滅菌后，用于細胞培養。

1.1.3 抗體小鼠抗人單克隆TGF?β抗體，購自abcam公司；兔抗人多克隆Smad4抗體購自protein?tech生物公司；兔抗人多克隆E?cadherin抗體，購自Santa Cruz公司；小鼠抗人單克隆N?cadhenrin抗體，購自cellsignal公司；抗β?tubulin鼠單克隆抗體購自中國北京康為世紀公司；山羊抗兔、山羊抗小鼠熒光抗體、DAPI、山羊血清購自自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養完全培養基培養MGC?803細胞，將培養瓶置于無菌恒溫培養箱（37℃、5%CO2）中，每兩天更換培養液一次，每3天傳一代，當細胞至對數生長期，收集并計數，種于60 mm培養皿中，接種數為2×106/皿，共八個皿。觀察細胞貼壁后，對照組加入PBS，實驗組加入0.3%DS，繼續置于培養箱，培養2、8、12、24 h，分別收集各組細胞備用。

1.2.2 克隆形成實驗將對照組加入PBS，實驗組加入0.3%DS繼續培養24 h，消化、計數后，分別以1 000個細胞/孔的密度接種到6孔板中，重復3孔。繼續培養2周，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌，0.1%結晶紫染色15 min。計數超過50個細胞的集落形成數。

1.2.3 劃痕實驗將細胞接種于6孔板中，待細胞融合率達到70%～80%時，用1 000 μL的槍頭比著直尺劃橫線，PBS沖洗3次，拍照。對照組和實驗組分別加入無血清培養基和0.3%DS，重復3孔，培養24 h，顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.4 Transwell侵襲實驗將預制小室從-20℃中取出，再水化后，實驗組和對照組均按5×104/孔接種于上室，下室為含有10%FBS的完全培養基，重復3孔。培養箱中培養24 h，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌，0.1%結晶紫染色15 min，顯微鏡下觀察，拍照，計數。

1.2.5 免疫熒光雙染細胞爬片，4%多聚甲醛固定20 min，Triton?100孵育20 min，3%過氧化氫反應15 min，山羊血清封閉20 min，孵育不同種屬來源的一抗置于4℃冰箱過夜，設陰性對照，熒光二抗孵育置于37℃溫箱、避光60 min，加DAPI，封片。在400倍鏡下隨機選取的5個視野，采圖。TGF?β和Smad4主要分布于胞質和胞核，TGF?β蛋白用紅色熒光標記，Smad4蛋白用綠色熒光標記，DAPI發藍色熒光用來標記細胞核。應用Image?Pro Plus軟件測定光密度（optical density，OD）值，各組均取5張圖的平均光密度值，應用Adobe Pho?toshop CS5合并圖片。

1.2.6 Western blot裂解蛋白，EP管冰上放置5 min，振蕩30 s，重復5次，然后離心去除細胞碎片及雜質，換新的EP管分裝蛋白。應用BCA法檢測蛋白濃度，100℃煮蛋白10 min。配膠、上樣、進行SDS?PAGE膠電泳，切膠、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育。用ECL化學發光液顯影、曝光。應用Image J軟件測量各條帶的灰度值，以β?tubulin為內參，用四個時間點目的蛋白與內參蛋白表達灰度值的比值來表示相對蛋白量。

1.2.7 RT?PCR檢測TGF?β、Smad4的mRNA表達水平用試劑盒分別提取對照組和實驗組4個時間點細胞的總RNA，用反轉錄試劑盒（OMEGA）將其反轉錄為cDNA。引物均為上海生工生物公司合成，TGF?β引物，F：5′?AACCCACAACGAAATCTAT?GAC?3′，R：5′?GCTGAGGTATCGCCAGGAAT?3′，擴增片段為205 bp。Smad4引物，F：5′?AACTTTCCC?AACATTCCT?3′，R：5′?TGCTGCTGTCCTGGCTGA?3′，擴增片段為113 bp。GAPDH引物，F：5′?AGG?TCCACCACTGACACGTT?3′，R：5′?GCCTCAAGAT?CATCAGCAAT?3′，擴增片段為310 bp。用Image J進行灰度值分析，以目的條帶比內參條帶灰度值表示相應mRNA的相對表達水平，比較實驗組與對照組不同時間TGF?β、Smad4的mRNA表達水平。

1.3 統計學方法使用SPSS 22.0軟件對實驗數據分析，各組數據均呈正態分布且存在方差齊性，采用獨立樣本t檢驗進行各時間點兩組間比較。結果P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DS抑制人胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲

2.1.1 DS對人胃癌細胞增殖的影響克隆形成實驗結果顯示（圖1），對照組克隆形成數為（257.7±3.528），實驗組克隆形成數為（142.3±9.025），差異具有統計學意義（P＜0.001），表明DS可以減弱胃癌細胞的增殖。

2.1.2 DS對人胃癌細胞遷移的影響劃痕實驗結果顯示（圖2），0 h實驗組劃痕距離為（296±3.055），對照組劃痕距離為（298.3±4.055），差異無統計學意義（P＜0.05）。24 h實驗組劃痕距離為（295.3±2.028），而對照組劃痕距離為（213.3± 5.044），差異具有統計學意義（P＜0.001）。表明DS減弱了胃癌細胞的遷移能力。

2.1.3 DS對人胃癌細胞侵襲的影響Transwell實驗結果顯示（圖3），對照組從上室侵入下室的細胞數為（252.7±5.783），實驗組侵襲的細胞數為（149.3±5.608），差異具有統計學意義（P＜0.001），證明應用DS可以顯著降低胃癌細胞的侵襲能力。

圖1 DS對MGC?803細胞增殖的影響Fig.1 Effect of DS on proliferation of MGC?803 cells

圖2 DS對MGC?803細胞遷移的影響Fig.2 Effect of DS on migration of MGC?803 cells

圖3 DS對MGC?803細胞侵襲的影響Fig.3 Effect of DS on invasion of MGC?803 cells

2.2 DS抑制胃癌細胞TGF?β表達、促進Smad4表達

2.2.1 DS對人胃癌細胞TGF?β、Smad4蛋白表達的影響熒光顯微鏡下可見，TGF?β蛋白表達處發紅色熒光，主要分布于胞質和胞核，Smad4蛋白表達處發綠色熒光，主要分布于胞質和胞核。將圖片合并后可見紅綠光重疊處發黃色熒光，說明TGF?β與Smad4存在共定位現象（圖4A）。對照組TGF?β熒光亮度在2、8、12、24 h，呈現逐漸增高的趨勢（0.054±0.003）、（0.064±0.004）、（0.063 ±0.002）、（0.065± 0.003），應用DS后各時間點熒光亮度比對照組明顯降低（0.050±0.000 5）、（0.045±0.000 7）、（0.051±0.003）、（0.042±0.001），8、12、24 h差異有統計學意義（P8＜0.005，P12＜0.01，P24＜0.001，圖4B），2 h差異無統計學意義。實驗組 Smad4熒光亮度（0.055±0.005）、（0.048±0.005）、（0.063±0.000 8）、（0.065±0.002）與對照組（0.036±0.003）、（0.025±0.004）、（0.034±0.001）、（0.045± 0.002）相比呈逐步升高，2、8、12、24 h差異均 有統 計學 意義（P2＜0.01，P8＜0.005，P12＜0.001，P24＜0.005，圖4C）。

圖4 細胞免疫熒光檢測對照組與實驗組2、8、12、24 h胃癌細胞TGF?β和Smad4的表達Fig.4 The expressions of TGF?β and Smad4 in gastric cancer cells were detected by immunofluorescence assay in the control group and the experimental group at 2，8，12 and 24 hours（× 400）

Western blot實驗結果見圖5A。對照組TGF?β蛋白2、8、12、24 h高表達（0.55± 0.01）、（0.63±0.04）、（0.69±0.04）、（0.74±0.03），應用DS后表達均降低（0.51±0.02）、（0.50±0.01）、（0.37±0.04）、（0.26±0.02），4個時間點差異均有統計學意義（P2＜0.05，P8＜0.005、P12＜0.001，P24＜0.001，圖5B）。對照組Smad4蛋白2、8、12、24 h表達量明顯減少（0.70±0.01）、（0.53±0.03）、（1.03±0.05）、（0.44±0.03），而應用DS后實驗組Smad4蛋白表達逐漸增高（0.88±0.07）、（1.16±0.02）、（1.31±0.08）、（0.72±0.10），各個時間點差異均有統計學意 義（P2＜0.05、P8＜0.001，P12＜0.01，P24＜0.05圖5C）。表明DS可以抑制胃癌細胞TGF?β蛋白表達、促進Smad4蛋白表達。

圖5 Western blot分別檢測對照組與實驗組2、8、12、24 h TGF?β和Smad4的表達Fig.5 Western blot was used to detect the expression of TGF?β and Smad4 in the control group and the experimental group at 2，8，12 and 24 hours

2.2.2 DS對人胃癌細胞TGF?β、Smad4mRNA表達的影響RT?PCR實驗結果見圖6A。應用DS后檢測TGF?β、Smad4的mRNA表達水平，實驗組TGF?β低表達（0.23±0.01）、（0.46±0.11）、（0.20 ±0.001）、（0.49±0.003）與對照組（0.25±0.01）、（1.03± 0.01）、（0.51±0.02）、（0.86±0.01）相比2、8、12、24 h四個時間點表達量均減少，8、12、24 h差異有統計學意義（P8＜0.05，P12＜0.005，P24＜0.001，圖6B），2 h差異無統計學意義。對照組Smad4在2、8、12、24 h表達量均明顯減少（0.60±0.02）、（0.80±0.02）、（0.56±0.03）、（0.51±0.03），而應用DS后2、8、12、24 h，實驗組Smad4表達逐漸增高（0.91±0.02）、（1.05±0.02）、（0.67±0.02）、（1.21±0.01），四個時間點差異均有統計學意義（P2＜0.001，P8＜0.001，P12＜0.05，P24＜0.001，圖6C）。表明 DS 可以抑制人胃癌細胞TGF?β mRNA表達、促進Smad4 mRNA表達。

2.3 DS對人胃癌細胞EMT的影響Western blot結果見圖7A。對照組2、8、12、24 h胃癌細胞中E?cadherin低表達，（1.32±0.04）、（1.25±0.02）、（1.28± 0.05）、（1.24±0.03），應用DS后各個時間點E?cadherin表達增高，（1.91±0.04）、（1.96±0.01）、（1.79± 0.07）、（2.15± 0.04），差異具有統計學意義（P2＜0.001，P8＜0.001，P12＜0.001，P24＜0.001，圖7A）。對照組N?cadherin在胃癌細胞中2、8、12、24 h均高表達（1.20±0.14）、（1.09±0.08）、（1.23±0.16）、（1.37±0.11），應用DS后各個時間點N?cad?herin表達降低，（0.58±0.09）、（0.72±0.05）、（0.49 ±0.03）、（0.41±0.04），差異具有統計學意義（P2＜0.001，P8＜0.005，P12＜0.005，P24＜0.001，圖7B）。

3 討論

胃癌是我國癌癥死亡的第二大原因，約占所有癌癥死亡人數的17.6%［6］，盡管隨著診療技術的提高，其病死率在全球范圍內有所下降，但患者復發轉移率高，預后仍然較差。腹膜轉移是預后不良的重要臨床指征，在轉移性胃癌中，超過55%～60%的患者存在腹膜腔轉移［7］。腹膜轉移的胃癌患者不能進行根治性手術，而由于靜脈化療藥物分布不充分，腹膜屏障阻滯及腫瘤化療耐藥，化療效果有限［8］。因此，迫切需要開發預防及治療胃癌的腹膜轉移藥物，以改善胃癌患者的預后，而DS正是具有這種潛力的藥物。

圖6 RT?PCR檢測對照組與實驗組2、8、12、24 h 胃癌細胞TGF?β和Smad4的表達Fig.6 RT?PCR was used to detect the expression of TGF?β and Smad4 in gastric cancer cells of control group and experimental group at 2，8，12 and 24 hours

圖7 Western blot檢測對照組與實驗組2、8、12、24 h 胃癌細胞N?cadherin和E?cadherin的表達Fig.7 Western blot analysis of N?cadherin and E?cadherin expression in gastric cancer cells of control group and experimental group at 2，8，12 and 24 hours

本組的細胞克隆形成實驗、劃痕實驗及Tran?swell侵襲實驗結果表明，與對照組相比實驗組胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲顯著被抑制，證明了DS可以抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

TGF?β/Smad4信號通路控制著細胞膜至細胞核的信號轉導，在癌癥的發生和發展中起著重要作用［9］。

TGF?β1可以增強癌細胞的浸潤能力，促進腫瘤的進展［10］。胰腺導管腺癌衍生的細胞表現出特別高的TGF?β1表達，癌癥晚期階段，TGF?β在腫瘤組織中積聚，最終導致EMT、遷移、侵襲和轉移形成［11］。研究［12］表明，胃癌患者血清和癌組織中TGF?β1高表達并與淋巴結受累和不良預后相關。本研究通過細胞免疫熒光雙染、Western blot、RT?PCR檢測不同時間點細胞中TGF?β的表達，發現在胃癌細胞中TGF?β在蛋白水平和mRNA水平均呈現高表達，而應用DS后各個時間點TGF?β的表達明顯降低，且隨著作用時間的延長這種抑制作用更為顯著，表明DS可能通過抑制TGF?β的表達，來抑制胃癌的侵襲和轉移。

Smad4作為Smads蛋白家族的重要成員，是TGF?β/Smads信號傳導的關鍵組件。研究表明，Smad4缺失使得非小細胞肺癌小鼠模型腫瘤體積的增大和惡性程度增高，還可引發自發性肺腫瘤形成并促進其的生長［13］。ZHENG 等［14］的研究表明，胃癌中Smad4呈低表達，且與腫瘤的侵襲、轉移和淋巴結轉移相關，Smad4可以抑制胃癌細胞的生長、侵襲和轉移，說明Smad4在胃癌發展過程中發揮抑癌功能。本研究通過細胞免疫熒光雙染、western blot、RT?PCR實驗，檢測胃癌細胞不同時間點Smad4的表達，結果顯示，對照組Smad4在四個時間點均呈低表達，表明在胃癌細胞中Smad4可能是一種抑癌基因，這與ZHENG等［14］研究結果一致。而應用DS后，Smad4表達顯著增高，表明DS通過促進胃癌細胞Smad4的表達，而發揮抑癌作用。

上皮間質轉化（epithelial?mesenchymal transi?tion，EMT）與腫瘤的轉移密切相關。在此過程中上皮細胞的極性喪失，與周圍細胞和基質接觸減少，遷移和運動能力增強，同時上皮表型丟失而逐漸獲得間質表型［15］。發生 EMT 的標志是 E?cad?herin表達降低，伴隨著N?cadherin或Vimentin表達的增加［16］。本實驗通過Western blot檢測了上皮標志物 E?cadherin和間充質標志物 N?cadherin，發現對照組各個時間點E?cadherin低表達而N?cadherin均為高表達，而應用DS后不同時間點E?cadherin表達增高，N?cadherin表達降低，證明DS可以抑制胃癌細胞的EMT。

綜上所述，DS可以顯著抑制人胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，其可能的分子機制是DS通過影響人胃癌細胞TGF?β/Smad4信號通路，從而抑制胃癌細胞的EMT，進而抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。