不同雜交桑品種桑葉活性物質含量的測定及藥用品質綜合評價

趙東曉 李公存 董亞茹 耿兵 陳傳杰 王照紅 婁齊年 孫景詩

摘要：為篩選適合食藥用雜交桑品種，測定了5個雜交桑品種的桑葉1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin， DNJ）、總黃酮、多糖、總多酚和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid， GABA）含量，并用隸屬函數法對桑葉的藥用品質進行綜合評價。結果表明，不同品種雜交桑桑葉DNJ、總黃酮、多糖、總多酚和GABA含量存在較大差異，5個雜交桑品種藥用品質從高到低依次為豐馳、秦桑、浙桑3號、浙桑1號、魯桑1號。

關鍵詞：雜交桑;桑葉;活性物質;藥用品質;綜合評價

中圖分類號：S548.01?文獻標識號：A?文章編號：1001-4942（2019）12-0100-06

Abstract?In order to select mulberry hybrids suitable for food and medicine， the contents of 1-deoxynojirimycin （DNJ）， total flavonoids， polysaccharides， total polyphenols and γ-aminobutyric acid （GABA） in leaves of five mulberry hybrids were determined， and the medicinal quality were comprehensively evaluated by membership function method. The results showed that there were significant differences in DNJ， total flavonoids， polysaccharides， total polyphenols and GABA contents between different hybrids. According to the comprehensive analysis by membership function method， the medicinal quality of the five mulberry hybrids from high to low was Fengchi， Qinsang， Zhesang 3， Zhesang 1 and Lusang 1， respectively.

Keywords?Mulberry hybrid;Mulberry leaves;Active substances;Medicinal quality;Comprehensive evaluation

桑樹是桑科（Moraceae）桑屬（Morus L.）多年生木本植物。桑葉既是家蠶唯一天然食物，又是一種傳統中藥材。桑葉含有豐富的營養生物活性物質，如黃酮類、多糖類、生物堿類、植物甾醇、多種維生素及礦物質等[1]，具有抗氧化、降血糖、抗腫瘤、提高人體免疫力等功能[2-4]。此外，桑葉蛋白質含量高，可用作飼料加工，具有消化率高、適口性好等特點[5]。桑葉有抗炎、抑菌的優點，可作為新型飼料添加劑，為無抗飼料的加工提供新思路[6]。

目前業內認為雜交桑葉片薄、葉質差，但雜交桑具有生長快、產葉量大，適宜機械化收割、牲畜適口性好等優點[7]，是飼料的理想材料。雜交桑作為飼料桑的開發利用成為近年來蠶桑產業多元化發展的重要方向之一。篩選高藥用品質的雜交桑品種對雜交桑無抗飼料開發利用有重要意義。本研究對收集的5個雜交桑葉片中1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin， DNJ）、總黃酮、多糖、總多酚和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid， GABA）含量進行檢測和綜合分析，旨在為雜交桑葉利用和高品質飼料桑開發提供理論依據和參考。

1?材料與方法

1.1?試驗材料和主要試劑

供試材料為一年生雜交桑第5～8葉位的成熟葉片，品系分別為豐馳、秦桑、魯桑1號、浙桑1號、浙桑3號。桑葉于2019年7月中旬采摘于山東省蠶業研究所南院試驗場桑園。采摘時間為上午9∶00，采摘后的桑葉用自來水清洗干凈后，用蒸餾水沖洗3遍，置于50℃烘干至恒重，粉碎后過60目篩，分裝于密封袋中，-40℃保存備用。

DNJ 標準品、蘆丁標準品、沒食子酸標準品、葡萄糖標準品、γ-氨基丁酸（GABA）標準品、9-芴基氯甲酸甲酯（FMOC-Cl） 、乙腈（色譜純），均為 Sigma 公司產品。甘氨酸、濃鹽酸、氫氧化鈉、乙醇、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸氫鈉、乙酸鋅、冰乙酸、亞鐵氰化鉀、碘、碘化鉀、濃硫酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、福林酚試劑、碳酸鈉、氯化鋁、氫氧化鉀、十水合四硼酸鈉、安替福民均為國產分析純。

1.2?試驗方法

1.2.1?桑葉DNJ的提取及含量檢測?按照文獻[8]的方法。

DNJ標準曲線制作：精確稱取DNJ標準品10 mg，用去離子水配置的0.05 mol/L HCl溶液溶解并定容至10 mL，得到濃度為1 mg/mL的DNJ標準品溶液，-40℃保存備用。精確吸取DNJ標準品溶液0、2、4、6、8、10、12、20 μL于5 mL離心管中，分別加入一定量的0.05 mol/L HCl溶液稀釋至100 μL。加入pH=8.5、0.4 mol/L硼酸鹽緩沖液100 μL，再加入濃度為5 mmol/L的FMOC-Cl/乙腈溶液200 μL，充分混勻，20℃反應20 min，再加入1 mol/L甘氨酸溶液100 μL終止反應;加入0.1%的冰醋酸溶液100 μL穩定生成的衍生物，混勻后加入去離子水500 μL。經0.22 μm濾膜過濾，濾液采用高效液相色譜（HPLC）法檢測分析。檢測條件為：反向色譜柱C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）;流動相為乙腈-0.1%冰醋酸（體積比45∶55），流速1 mL/min，柱溫28℃，熒光檢測器波長254 nm，進樣量20 μL，停止時間30 min。以DNJ標準品溶液質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，制作標準曲線。

準確稱取桑葉粉0.2 g，加入0.05 mol/L HCl溶液定容至10 mL，渦旋30 s后超聲提取30 min，12 000 r/min 離心15 min，上清液即為DNJ 提取液。取DNJ提取液100 μL，按照DNJ標準曲線制作方法進行衍生化處理和色譜檢測，參照標準曲線，計算桑葉DNJ含量。

1.2.2?桑葉總黃酮的提取及含量檢測?按照文獻[9]的方法。

總黃酮標準曲線制作：準確稱取蘆丁標準品10 mg于50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，得到濃度為0.2 mg/mL蘆丁對照品溶液，-40℃保存備用。精確吸取蘆丁對照品溶液0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL于5 mL離心管中，再分別加入一定量的70%乙醇溶液稀釋至1.00 mL。加入質量分數5%的 NaNO2 60 μL，搖勻后靜置6 min，加入10%Al（NO3）3 60 μL，混勻后靜置6 min，再加入4%的NaOH溶液800 μL，用70%乙醇稀釋至2 mL，搖勻后靜置10 min。測定各管510 nm吸光值，以同樣處理的0 mL蘆丁對照品溶液進行空白校正，制作標準曲線。

準確稱取桑葉粉0.5 g，加入70%乙醇定容至50 mL，超聲提取20 min后，60℃水浴3 h，過濾并收集濾液。4℃靜置過夜，上層液即為待檢測液。取200 μL待測液，加入70%乙醇800 μL稀釋后，按照制作標準曲線方法測定各樣品510 nm吸光值，參照標準曲線，計算桑葉總黃酮的含量。

1.2.3?桑葉多糖的提取及含量檢測?按照文獻[10]的方法。

多糖標準曲線制作：精確配制1.056 mg/mL的葡萄糖標準品溶液。分別吸取0、0.08、0.16、0.24、0.32、0.40、0.48、0.56、0.64 mL葡萄糖對照品溶液，加至10 mL具塞比色管中，以0 mL葡萄糖標準品溶液作為空白對照，加蒸餾水稀釋至0.80 mL。分別加入60 μL DNS試劑，搖勻，沸水浴5 min后立即置于冰水中冷卻，用蒸餾水定容至10 mL，測定各管540 nm吸光值。以葡萄糖質量（mg）為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

提取5個雜交桑品種桑葉水溶性糖和總糖，按照制作標準曲線的方法測定540 nm吸光值，分別計算各品種桑葉水溶性糖和總糖含量。多糖含量=（總糖含量-水溶性糖含量）×0.9×100%。

1.2.4?桑葉總多酚的提取及含量檢測?按照文獻[11]的方法。

總多酚標準曲線制作：準確稱取沒食子酸標準品20 mg于200 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，得到濃度為0.1 mg/mL沒食子酸對照品溶液，-40℃保存備用。精確吸取沒食子酸對照品溶液0、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16 mL于5 mL離心管中，再分別加入一定量的蒸餾水稀釋至1.00 mL。各管中加入1 mL 福林酚試劑，混勻后靜置10 min，然后加入10% Na2CO3 溶液2 mL，混勻后25℃遮光反應1 h 顯色。測定各管765 nm吸光值，以同樣處理的0 mL沒食子酸對照品溶液進行空白校正，制作標準曲線。

準確稱取桑葉粉0.5 g，加入pH=4.0 的70%乙醇并定容至50 mL，超聲提取30 min后，60℃水浴90 min，冷卻后12 000 r/min離心10 min，上清即為桑葉總多酚提取液。取25 μL提取液，加入pH =4.0 的70%乙醇950 μL稀釋，按照總多酚標準曲線測定方法檢測各樣品765 nm吸光值，參照標準曲線，計算桑葉總多酚的含量。

1.2.5?桑葉GABA提取及含量檢測?按照文獻[12]的方法。

GABA標準曲線制作：準確稱取GABA標準品10 mg，用蒸餾水溶解并定容至10 mL，配制成1 mg/mL GABA對照品母液，-40℃保存備用。精確吸取GABA對照品溶液0、0.125、0.250、0.375、0.500、0.625、0.750、0.875、1.000 mL，加蒸餾水稀釋至1.000 mL，加入2 mol/L AlCl3溶液50 μL，充分搖勻后振蕩10 min，12 000 r/min離心 5 min，取500 μL上清液，加入濃度為1 mol/L 的KOH溶液300 μL，振蕩5 min后12 000r/min離心5 min。取300 μL上清液，依次加入pH=10.0的0.1 mol/L四硼酸鈉緩沖液500 μL、6%苯酚400 μL、50 g/L NaClO 溶液600 μL，每一步均充分混勻。沸水浴中加熱10 min后置于冰水浴5 min，待溶液出現藍綠色后，加入60%乙醇2.0 mL，測定645 nm吸光值。以GABA質量（mg）為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

準確稱取0.05 g桑葉粉于離心管中，加入100%甲醇2 mL，振蕩 15 min后5 000 r/min離心15 min，棄上清液。重復2次上述操作。將離心后收集的沉淀物烘干后加蒸餾水2 mL，超聲波提取20 min后，50℃水浴中提取2 h，5 000 r/min離心15 min，上清即為桑葉GABA提取液。吸取1 mL提取液，按照GABA標準曲線制作方法，測定各樣品645 nm吸光值。參照標準曲線，計算桑葉GABA的含量。

1.2.6?桑葉藥用品質綜合評價?參照文獻[13]中的方法，借助隸屬函數，分別將桑葉DNJ、總黃酮、多糖、總多酚和GABA含量測定值標準化，計算各指標的隸屬函數值，公式為：X（i）= （Xi-Ximax）/（Ximin-Ximax）。式中，X（i）表示桑葉藥用品質綜合評價中第i類成分的隸屬函數值，Xi表示桑葉第i類藥用成分含量實際測定值，Ximin和 Ximax分別表示桑葉第i類藥用成分含量中的最小測定值和最大測定值。對桑葉DNJ、總黃酮、總多酚、多糖和GABA隸屬函數值累加求和，將其作為雜交桑葉藥用品質綜合評價得分。

1.3?數據處理與分析

用Microsoft Excel 2007和SPSS 20軟件對試驗數據進行處理與統計分析。

2?結果與分析

2.1?不同桑品種桑葉中的DNJ含量比較

如圖1所示，5個雜交桑品種桑葉中的DNJ含量在0.23～0.50 mg/g之間。其中，豐馳含量最高（0.50 mg/g），極顯著高于其它品種。其次為魯桑1號（0.34 mg/g）、浙桑3號（0.33 mg/g）、浙桑1號（0.29 mg/g）。秦桑含量最低（0.23 mg/g），是豐馳的46.00%。

2.2?不同桑品種桑葉中的總黃酮含量比較

如圖2所示，5個雜交桑品種桑葉中的總黃酮含量差異較大。其中豐馳含量最高，為4.74 mg/g，極顯著高于其它品種。其次為秦桑，含量為3.73 mg/g，比豐馳低21.32%。再次為魯桑1號，含量為3.21 mg/g，比豐馳低32.33%。浙桑1號含量為3.17 mg/g，比豐馳低33.24%。浙桑3號含量最低，僅為3.05 mg/g，比豐馳低35.76%。

2.3?不同桑品種桑葉中的多糖含量比較

如圖3所示，5個雜交桑品種桑葉中的多糖含量由高到低依次為豐馳、秦桑、浙桑1號、浙桑3號和魯桑1號，多糖含量依次為16.10、15.93、15.86、15.55 mg/g和14.31 mg/g。其中魯桑1號多糖含量極顯著低于豐馳、秦桑、浙桑1號和浙桑3號。

2.4?不同桑品種桑葉中的總多酚含量比較

如圖4所示，5個雜交桑品種桑葉中的總多酚含量在15.18～22.67 mg/g。由高到低依次為豐馳、秦桑、魯桑1號、浙桑1號和浙桑3號，其中豐馳總多酚含量為22.67 mg/g，極顯著高于其它品種。

2.5?不同桑品種桑葉中的GABA含量比較

如圖5所示，5個雜交桑品種桑葉中的GABA含量在3.67～4.16 mg/g。浙桑3號、秦桑、浙桑1號、魯桑1號和豐馳GABA含量依次為4.16、4.14、3.93、3.85 mg/g和3.67 mg/g。各品種間桑葉GABA含量差異不顯著。

2.6?桑葉藥用品質綜合評價得分比較

將桑葉DNJ、總黃酮、多糖、總多酚和GABA 5種生物活性物質作為雜交桑藥用品質的評價指標，用模糊數學的隸屬函數平均值大小表示其相對優劣，計算隸屬函數平均值，并對其藥用品質優劣進行綜合排序，隸屬平均值越大，表明該品種藥用品質越高。由表1可見，5個雜交桑品種藥用品質從高到低依次為豐馳、秦桑、浙桑3號、浙桑1號、魯桑1號。

3?討論與結論

DNJ是首次從桑樹中分離得到的一種生物堿，能有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，從而有降血糖的作用，能有效預防和治療Ⅱ型糖尿病[14]。越來越多的研究發現，DNJ存在于多種微生物[15，16]和植物[17，18]中，而桑樹是目前發現的DNJ含量最高的植物[1]。本研究檢測的5個雜交桑品種葉片DNJ含量存在極顯著差異，含量在0.23～0.50 mg/g之間，與張俊[1]、曾衛湘[10]等的研究結果相比偏低。

黃酮是一類植物次生代謝產物，目前研究認為生物和非生物脅迫可刺激植物產生黃酮類物質[19]。桑葉黃酮具有清除自由基、抗菌、抗癌、抗病毒、降血糖、降血脂等功效[20]。本研究檢測的5個雜交品種桑葉總黃酮含量在3.05～4.74 mg/g之間，存在極顯著差異，與敬成俊等[12]的研究結果相符。

多糖是桑葉中的主要活性物質之一，具有顯著的降血糖血脂、抗氧化、調節免疫力等功能[10]。目前研究認為桑葉多糖含量與品種、產地、氣候、處理方式有顯著的相關性[21]。本研究檢測的5個雜交桑品種葉片多糖含量在14.31～16.10 mg/g之間，存在極顯著差異，與曾衛湘等[10]的研究結果相比偏低，與敬成俊等[12]的研究結果相符。

多酚是一種植物酚類次生代謝產物，廣泛存在于植物的葉片、根、皮、果實等部位。桑葉總多酚具有抗輻射、抗衰老、抗氧化、防治腫瘤、增強機體免疫力、治療脂肪肝等功能[22]。本研究檢測的5個雜交品種桑葉總多酚含量在15.18～22.67 mg/g之間，存在極顯著差異，與敬成俊等[12]的研究結果相比偏高，與沈維治等[22]的研究結果相符。

GABA是廣泛存在于植物體中的一種非蛋白質氨基酸類天然活性成分，對人體的神經系統發育具有重要調節作用，有抗焦慮、降血壓等作用[23]，對植物有增強逆境脅迫的功能[24]。桑樹是一種GABA含量較高的植物。本研究檢測的5個雜交桑品種葉片GABA含量在3.67～4.16 mg/g之間，差異不顯著，與冀憲領等[23]研究結果相比偏高、與王瑞嫻等[25]的研究結果相符。

本研究中雜交桑葉生物活性成分含量與以往研究有所不同，一方面可能與供試雜交桑品種本身遺傳背景和生理特性有關;另一方面，不同氣候因素和栽培條件，如光照、溫度、濕度、降雨量和土壤類型等對植物次生代謝產物含量也會產生一定的影響[19，26]。

本研究供試的5個雜交桑品種中，豐馳是桑葉DNJ、總黃酮、多糖、總多酚含量最高的優勢品種，浙桑3號是GABA含量最高的優勢品種。通過隸屬函數法將5個品種桑葉DNJ、總黃酮、多糖、總多酚和GABA含量標準化，以5種藥用成分隸屬函數平均值對各品種桑葉藥用品質進行綜合評價，結果表明5個雜交桑品種藥用品質最高的為豐馳，可作為食藥專用雜交桑品種的候選。本研究為藥食專用雜交桑品種的選育提供了科學依據。

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