沉默AFP表達對肝癌細胞侵襲轉移的影響及機制

蘇純潔，何前進，毛偉明，張喜華，岑紅兵，張松柏

(1荊門市第一人民醫院，湖北荊門448000；2黃岡市中心醫院)

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發病率和病死率均居世界第一[1]。近年來盡管肝癌的診斷和治療有了長足進步，但肝癌的預后并未得到明顯改善，主要原因在于肝癌的肝內和肝外轉移[2]。肝癌較易轉移的原因和相關機制尚不清楚。我們前期研究顯示血清甲胎蛋白(AFP)水平和肝癌的侵襲轉移相關。血清AFP>400 μg/L的肝癌患者較易出現腫瘤侵犯和術后轉移[3]。AFP是肝細胞合成并分泌到血液中的一種糖蛋白，被視為肝癌診斷的血清標志物，在肝癌的篩查、臨床診斷、術后復發監測過程中發揮重要作用。近年來研究發現AFP同肝癌預后密切相關，具有復雜的生物學功能[4,5]。研究發現，AFP可影響肝癌細胞的增殖,抑制細胞凋亡[4,5]。AFP同肝癌侵襲轉移的研究不多，相關機制尚不清楚。基質金屬蛋白酶(MMPs)是最重要的一組蛋白酶，與肝癌的侵襲轉移密切相關。2018年3～9月，我們探討了沉默AFP表達對肝癌細胞侵襲轉移的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌細胞系Hep3B細胞由武漢同濟醫院肝臟外科董漢華副主任醫師饋贈。兔抗人AFP單克隆抗體購于Cell signaling公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體購自Santa Cruz公司。Transwell小室購于美國Corning公司。Matrigel購于美國BD公司。轉染試劑脂質體Lipofectamine2000購于美國Life Technologies公司,DMEM、胎牛血清由Hyclone公司提供,PCR 引物購于Invitrogen公司。AFP干擾的慢病毒載體購自上海吉凱基因化學技術有限公司。

1.2 細胞分組及慢病毒轉染 將處于對數生長期的Hep3B細胞隨機分為Hep3B/shRNA-AFP組、Hep3B/shRNA-control組，消化后種于6孔板中，用含有5%的胎牛血清DMEM培養基培養，待生長至65%融合時，將AFP干擾的慢病毒載體和對照病毒載體，按照感染復數為30(感染復數=病毒活性單位數/細胞數)的比例滴加到細胞培養液中。感染16 h后，吸出含慢病毒顆粒的培養液，更換培養液，繼續培養。培養5 d后的細胞用于后續實驗。

1.3 AFP蛋白表達檢測方法 采用Western blotting法。裂解并提取腫瘤組織蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，進行蛋白定量后在12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上以每孔20 μL蛋白上樣，進行電泳后將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用1∶1 000稀釋的兔抗人AFP抗體，4 ℃孵育過夜，β-actin作為內參。第2天，分別用1∶3 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的抗兔或抗鼠的二抗進行孵育后，用化學發光法在暗室內進行曝光、顯影和定影。

1.4 細胞侵襲能力檢測 進行細胞劃痕實驗。分別將感染AFP干擾慢病毒和對照慢病毒載體的 Hep3B細胞按每孔2×105個細胞均勻接種在6孔板上，次日觀察細胞完全貼壁后用10 μL的無菌槍頭在細胞表面劃一橫線，PBS洗滌3次去除脫落細胞脆片，加入無血清DMEM培養基。放回37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養，分別于0、8和24 h在顯微鏡下觀察拍照，實驗重復3次。Image J軟件分析劃痕細胞擴增速度，統計空白區域占原始劃痕區域面積的百分比。

1.5 細胞侵襲能力檢測 進行Transwell實驗。使用具有孔徑為8.0 μm的聚碳酸酯膜過濾器的Transwell小室評估肝癌細胞侵襲能力。Transwell小室用Matrigel 1∶100比例稀釋預處理，37 ℃培養箱中放置2 h。之后，將小室放入24孔板中，細胞按1×105個/室的密度接種于上室中，上室液體總體積為200 μL。下室加入含10%胎牛血清DMEM培養基600 μL，每組設3個復孔。培養24 h后取出Transwell小室，PBS沖洗，多聚甲醛室溫下固定20 min，結晶紫染液染色5 min，蒸餾水沖洗。顯微鏡下對侵襲至微孔膜下層的細胞計數。

1.6 沉默AFP前后Hep3B細胞中MMPs mRNA的表達檢測 采用real-time PCR方法。RNA提取試劑TRIzol提取細胞總RNA，利用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度。取相同量的 mRNA逆轉錄為cDNA，以基因引物加熒光染料復合物SYBR Green Mix(2×)進行定量PCR，每個反應做3個復孔。熒光定量 PCR擴增反應體系為：cDNA模板1.5 μL，10 μmol/L的正向和反向引物各1 μL，SYBR Green Mix 10 μL，ddH2O 6.5 μL，總反應體系為20 μL。每個樣本設3個復孔。反應條件：94 ℃ 5 min，1個循環;然后94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃1 min，33個循環;最后72 ℃延伸10 min，1個循環。選用β-actin做為內參引物。MMP1正向引物5′-CTGCTTACGAATTTGCCGACAGA-3′，反向引物5′-GTTCTAGGGAAGCCAAAGGAGCTG-3′，擴增產物長度130 bp；MMP2正向引物5′-GTTCATTTGGCGGACTGTGACG-3′，反向引物5′-ATTCATTCCCTGCAAAGAACACAGC-3′，擴增產物長度146 bp；MMP3正向引物5′-GGACAAAGGATACAACAGGGACCA-3′，反向引物5′-GAACCGAGTCAGGTCTGTGAGTG-3′，擴增產物長度140 bp；MMP7正向引物5′-GATGGGCCAGGAAACACGC-3′，反向引物5′-CCTAGACTGCTACCATCCGTCCA-3′，擴增產物長度107 bp；MMP9正向引物5′-CACGACGTCTTCCAGTACCGAGA-3′，反向引物5′-CATAGGTCACGTAGCCCACTTGGT-3′，擴增產物長度115 bp；MMP10正向引物5′-TCTGTTCCTTCGGGATCTGAGATG-3′，反向引物5′-TGAAATTCAGGTTCAGGGTTCCAGT-3′，擴增產物長度146 bp；MMP11正向引物5′-ACCTGGACTATCGGGGATGA-3′，反向引物5′-GGCTGGCCATATAGGTGTTG-3′，擴增產物長度188 bp；MMP14正向引物5′-CAGAGAAGGCACACAAACGA-3′，反向引物5′-CACTGGTGAGACAGGCTTGA-3′，擴增產物長度172 bp；MMP15正向引物5′-GGCCGACATCATGGTACTCT-3′，反向引物5′-GAGGTTGTTTCCATGCAGGT-3′，擴增產物長度178 bp；MMP17正向引物5′-GGTGCGTGCACTCATGTACT-3′，反向引物5′-GAAGGGGTAGCCGTCGTTAT-3′，擴增產物長度136 bp；MMP21正向引物5′-TCAAAGGCAATGCATACTGG-3′，反向引物5′-CGAAGTCCTATGACCCTCCA-3′，擴增產物長度186 bp；MMP24正向引物5′-AGTTTGTGACCGTCCTCCAC-3′，反向引物5′-AGCCATCTCTGCCTCACCTA-3′，擴增產物長度112 bp；MMP25正向引物5′-TTAACTAGTCGCGGGGATTG-3′，反向引物5′-ACTGAGGCTGGACAGCAACT-3′，擴增產物長度172 bp；β-actin正向引物5′-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTGAC-3′，反向引物5′-GCTCGCTCCAACCGACTGC-3′，擴增產物長度 171 bp。

2 結果

2.1 Hep3B/shRNA-control、Hep3B/shRNA-AFP細胞中AFP mRNA和蛋白表達比較 real-time PCR結果顯示，Hep3B/shRNA-AFP組細胞中AFP mRNA表達量為Hep3B/shRNA-control組的(0.12±0.02)倍。Western blotting檢測結果和real-time PCR結果一致，顯示Hep3B/shRNA-AFP組細胞中AFP蛋白表達低于Hep3B/shRNA-control組。shRNA-AFP的干擾效率符合下一步實驗要求。

2.2 沉默AFP表達對肝癌細胞Hep3B細胞侵襲能力的影響 Hep3B/sh-AFP組24h后空白區域占原始劃痕區域面積百分比為77.1%±1.5%，Hep3B/shRNA-control組為51.3%±1.5%，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 沉默AFP表達對肝癌細胞Hep3B轉移能力的影響 Hep3B/sh-AFP組、Hep3B/shRNA-control組穿透濾膜的細胞數分別為(463±47)、(718±23)個/HP，與Hep3B/shRNA-control組相比，Hep3B/sh-AFP組穿透濾膜的細胞數減少(P<0.05)。

2.4 沉默AFP表達對肝癌細胞Hep3B中MMPs基因表達的影響 Hep3B/sh-AFP組、Hep3B/shRNA-control組MMP1相對表達量分別為1.04±0.09、0.92±0.39，MMP2相對表達量分別為0.83±0.72、0.98±0.86，MMP3相對表達量分別為0.95±0.41、0.94±0.17，MMP7相對表達量分別為0.97±0.39、0.98±0.38，MMP9相對表達量分別為0.84±0.16、1.01±0.13，MMP10相對表達量分別為0.99±0.09、1.01±0.10，MMP11相對表達量分別為0.24±0.29、1.00±0.88，MMP14相對表達量分別為0.98±0.10、0.99±0.10，MMP15相對表達量分別為0.84±0.43、0.98±0.08，MMP17相對表達量分別為0.63±0.23、1.02±0.26，MMP21相對表達量分別為5.44±0.72、1.23±0.46，MMP24相對表達量分別為0.98±0.41、0.97±0.25，MMP25相對表達量分別為0.32±0.21、1.00±0.07，兩組MMP2、MMP9、MMP11、MMP15、MMP17和MMP25表達差異有統計學意義(P均<0.05)。

3 討論

肝細胞癌占原發性肝癌的90%左右,其較易發生肝內和肝外轉移。肝癌根治性切除是目前最有效的治療手段，但研究發現即使接受根治性手術，50%的患者仍會在5年內出現轉移[2]。我們前期研究結果顯示患者血清中AFP水平和肝癌侵襲轉移密切相關。AFP>400 μg/L的肝癌患者中,28.2%(31/110)的患者腫瘤組織侵犯了血管；在AFP≤400 μg/L的肝癌患者中,16.5%(44/266)的患者腫瘤組織侵犯了血管，兩者間存在統計學差異。AFP>400 μg/L的肝癌患者中根治術后1、3、5年轉移率分別為17.6%(12/68)、38.2%(26/68)、45.6%(31/68)； AFP≤400 μg/L的肝癌患者中根治術后1、3、5年轉移率分別為7.6%(13/171)、23.4%(40/171)、31.6%(54/171)，兩者間存在統計學差異[3]。上述結果表明AFP和肝癌的侵襲轉移密切相關，此與文獻報道一致[4,5]。

本研究先在細胞水平上觀察了AFP對肝癌細胞侵襲能力和轉移能力的影響，與體內結果一致。因MMPs是目前已知間質膠原蛋白惟一的基質降解酶，能降解除多糖外的細胞外基質所有成分，故我們檢測了AFP對MMP基因家族的影響。本研究結果顯示，AFP表達下調可引起Hep3B細胞中MMP2、MMP9、MMP11、MMP15、MMP17和MMP25表達下調。

目前研究發現MMP家族成員已增加到26個，基因間具有較高同源性[6～11]。研究顯示MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP16均在肝癌組織中高表達，其同肝癌的侵襲轉移密切相關[6～12]。本研究結果顯示AFP選擇性地調控部分MMP基因表達，而對另一部分MMP基因如MMP1、MMP3、MMP7、MMP10、MMP14、MMP24表達無明顯影響，原因有待進一步研究。有文獻[12]報道AFP可通過上調MMP2和MMP9促進HLE細胞的侵襲和轉移，與本研究結果一致。

本研究表明AFP是一個潛在有生物學功能的蛋白。AFP表達升高后可激活PI3K/AKT信號,進而誘導Ras基因和Src基因表達,最終引起肝細胞的惡性轉化。AFP還可通過調控細胞內第二信使遞質Ca2+和cAMP的濃度,使蛋白酶A活性上升，從而促進細胞內DNA等物質的合成[4,5]。

綜上所述，沉默AFP表達可降低肝癌細胞的侵襲和轉移能力，其機制可能與抑制MMP2、MMP9、MMP11、MMP15、MMP17和MMP25表達有關。