焦亡及其在心血管疾病中的作用研究進展

周志友，陳佩兒，鄭杰，程宇，陳燦

(廣東醫科大學附屬醫院,廣州534023)

近年研究發現，消化道皮膚素(GSDM)家族具有誘導細胞死亡與炎癥的作用，特別是消化道皮膚素D(GSDMD)與細胞焦亡密切相關。炎癥體是一種細胞質內形成的復合體，可激活Caspase-1再水解pro-IL-1β與pro-IL-18。此能誘導一種新的程序性死亡--焦亡。細胞焦亡是以細胞腫脹、細胞膜破裂、炎癥因子釋放為特征的死亡方式[1]。 GSDMD之所以成為焦亡的執行者，主要因為其被Caspases水解之后具有的打孔效應。一般情況下完整的GSDMs分子不會誘導細胞焦亡，但當其被切割為N段與C段時，由于N段不再受C段的限制，N段便能與胞內膜相互結合形成穿孔效應[2]。此外，有相關證據表明GSDME亦能誘導細胞焦亡，而GSDMs家族中的PJVK至今仍無證據表明其與孔膜形成有關[2]。近年研究發現，細胞焦亡在心血管疾病(動脈粥樣硬化、心肌梗死與缺血再灌注、糖尿病心肌病、心力衰竭等)發生進展等方面起重要作用?，F將焦亡及其在心血管疾病中的作用研究進展綜述如下。

1 細胞焦亡的概念及分子機制

細胞焦亡是新近發現的一種程序性細胞死亡形式，由微生物感染和內源性損傷相關信號誘導,依賴炎性 Caspase-1/4/5/11介導，伴有大量促炎因子的釋放，誘發級聯放大的炎癥反應[3]。

細胞焦亡的分子機制主要分為兩種:依賴于Caspase-1的經典途徑和依賴Caspase-4/5/11的非經典途徑。炎癥小體是一種由機體模式識別受體(PRRs)參與組成的蛋白復合物體，由PRRs與特定配體結合，再結合其他蛋白所構成。每個炎癥小體由 1 個 Caspase 的激活域和募集域(CARD)和/或 1 個熱蛋白結構域(PYD)組成。病原體入侵時，含有CARD結構域的炎癥小體直接募集pro-Caspase-1，并使其自身水解，產生具有酶活性的Caspase-1，活化的Caspase-1水解IL-β與IL-18并以活性的形式釋放至胞外，誘發細胞焦亡。不含 CARD 結構域的炎癥小體，則通過含CARD結構域的凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)募集pro-Caspase-1。非經典細胞焦亡通路則通過 Caspase-4/5/11直接識別并結合細菌脂多糖(LPS)而激活。活化的 Caspase-1/4/5/11將GSDMD蛋白切割為具有成孔活性的GSDMD-N末端，GSDMD-N與細胞內膜結合形成孔道，致使細胞溶脹與滲透性裂解，誘發細胞焦亡。

2 焦亡信號的感知與啟動

生物體內識別受體由模式識別受體(PRRs)、病原菌相關分子模式(PAMPs)與危險相關分子模式(DAMPs)組成，不僅作為人類先天性免疫對抗微生物侵襲的第一道防線，而且還具有保守與特征性的結構位點，這使得其能識別自身與異己。當細胞識別PAMPs與DAMPs信號后，炎癥小體開始形成[3]。炎性小體由NACHT、LRR和PYD結構域的蛋白、凋亡相關斑點樣蛋白 (ASC)、pro-Caspase-1所組成的多蛋白復合物構成。接頭蛋白ASC含有 CARD和 PYD 結構域，通過 CARD-CARD和PYD-PYD結合的方式，形成的雙重接頭蛋白分子將炎性小體和 pro-Caspase-1 以橋梁的方式連接起來，并水解前Caspase-1，生成具有催化活性的 Caspase-1，作用于 pro-IL-1β、pro-IL-18 與GSDMD，生成有活性的IL-1β、IL-18與具有成孔效應的GSDMD-N末端，誘導細胞焦亡[3]。

3 細胞焦亡的執行者

3.1 GSDMD GSDMD 在食管、胃與皮膚表達，在這些部位的表達模式表明宿主對病原菌的入侵具有防御作用。相關證據表明，GSDMD作為Caspases底物，被切割水解產生具有與細胞內膜結合的效應片段，并在細胞膜上形成孔洞，導致細胞焦亡。通過敲除或低表達GSDMD，研究者發現鼠骨髓來源的巨噬細胞在對其進行脂多糖處理后，相比野生型，其不形成由Caspase-11依賴的焦亡[4]。

進一步研究發現，GSDMD 能被Caspase-1/4/5/11水解切割成30 kD N-氨基酸效應片段與25 kD C-氨基酸抑制片段。當GSDMD水解后，產生的GSDMD-N會與細胞內膜的磷脂酰肌醇磷酸鹽結合[5]。

GSDMD結合形成孔徑后，不僅能誘導細胞腫脹與焦亡，并且在細胞未完全溶解前促進炎癥因子釋放。GSDMD誘導細胞焦亡的抗菌效應，是通過釋放死亡細胞內的病原菌實現的。通過這種方式，能使病原菌被巨噬細胞與免疫細胞捕捉與消滅。深入研究發現，焦亡還能誘導細胞間通道的形成，使病原菌能在溶解的細胞內容物殘留中被捕獲，從而被體內的吞噬細胞捕獲與清除[6]。

3.2 GSDMA 人類的基因組只能編碼一個單獨GSDMA，而鼠類則編碼GSDMA1、GSDMA2、GSDMA3三個亞型。人GSDMA與鼠GSDMA3由兩個自我抑制結構組成：N-氨基酸段受到C-氨基酸段抑制。與GSDMD的N端結構域類似，293T 細胞中如果過表達GSDMA 與 GSDMA3的N端結構，亦會在細胞膜上形成孔徑，誘導類似細胞焦亡的特征[7]。腫瘤壞死因子誘導的角質細胞凋亡需鼠來源GSDMA3。腫瘤壞死因子能上調GSDMA3表達，這又會促進Caspase-3表達與細胞凋亡的產生。過表達胃上皮細胞系中的人來源的GSDMA3能誘導以Caspase-3、Caspase-7激活為特征的細胞凋亡。

3.3 GSDMB 人能編碼GSDMB，而鼠則不能。GSDMB至少有四個剪切變異體，相對分子質量為35～50 kD。GSDMB的整個蛋白與N端片段均能結合細胞內膜，這種結合方式使其區別于GSDMs 其他家族[8]。此外，GSDMB這種結合細胞膜的方式表明GSDMB-C末端不能抑制GSDMB-N末端與細胞膜結合。盡管如此，對于HEK293T細胞而言，只有GSDMB-N端才能誘導細胞焦亡的產生[7]。

3.4 GSDMC 對于GSDMC人類只能編碼一種蛋白，而鼠則有四個亞型。與GSDMs其他的家族類似，在293T細胞中，過表達GSDMC-N端亦會誘導細胞焦亡[7]。

3.5 GSDME 與GSDMD被Caspase-1水解不同，GSDME的水解需Caspase-3，而它是內源性與外源性凋亡中共同的靶點[9, 10]。內源性凋亡主要導致線粒體膜通透性改變，外源性凋亡則是凋亡小體聚集后激活Caspase-9。在267-270位點，Caspase-3水解GSDME生成的GSDME-N末端使細胞膜穿孔，誘導細胞焦亡[10]。進一步研究發現，對于HEK293T細胞系，敲除GSDME能增加氧化應激產物凋亡與壞死的產生。在GSDME缺陷的巨噬細胞中，Caspase-3激活凋亡相關因子受體與細胞色素C并導致細胞膜損傷，這表明GSDME表達并不影響細胞壞死。

近年來，研究發現化療藥物如拓撲替康、依托泊苷、順氯氨鉑，通過介導Caspase-3切割GSDME產生焦亡現象[9]。而將不表達GSDME的HeLa細胞系，進行轉染表達GSDME后，在TNF-α刺激下，細胞發生焦亡[9]。GSDME可作為化學藥物理療的一個潛在作用靶點。

4 細胞焦亡在心血管疾病中的作用

4.1 細胞焦亡在動脈粥樣硬化中的作用 動脈粥樣硬化是一種慢性進行性疾病，其特征是在大動脈中出現異常的脂質沉積，斑塊形成后導致管腔狹窄，隨后斑塊破裂，誘發心、腦、腎等重要器官栓塞的現象。近年來，越來越多的證據認為炎癥是導致動脈粥樣硬化的首要原因[11, 12]。動脈粥樣硬化是一種與內皮功能障礙相關的炎癥性疾病。焦亡導致內皮細胞的功能障礙是疾病進展的關鍵原因[13, 14]。褪黑素有非常強的抗炎作用，對動脈粥樣化鼠的模型進行12周褪黑素灌胃處理能明顯降低模型鼠頸動脈斑塊的形成，這說明褪黑素減緩動脈粥樣硬化小鼠動脈內皮細胞的焦亡是通過抑制機體的炎癥起作用的[12]。此外，還有研究發現香煙中的尼古丁通過ROS-NLRP3信號通路誘導內皮與巨噬細胞的焦亡，亦是導致動脈粥樣硬化病情加重的重要因素[15]。

4.2 細胞焦亡在急性心肌梗死和心肌缺血再灌注損傷中的作用 對于急性心肌梗死的患者，當前最佳的治療方案是進行急診PCI，盡快恢復冠脈血供，以減少心肌細胞死亡[16]。越來越多的證據表明，缺血再灌注后，炎癥體-Caspase軸在炎癥誘導的細胞死亡中起重要作用。炎癥體是一個復合體，其能將Pro-Caspase-1變成活化的Caspase-1。活化的Caspase-1不僅能將pro-IL-1β轉化為成熟的IL-1β與IL-18，而且還可對GSDMD進行切割成具有成孔效應的GSDMD-N末端，誘導細胞焦亡[17]。此外，激活缺血再灌注保護酶(PISK)、PI3k-AKT信號通路對缺血再灌注有一定保護作用[18]。研究發現，對離體鼠的心臟進行缺血再灌注處理，用Caspase-1的抑制劑VX-765處理后，能降低缺血再灌注損傷，這主要與抑制Caspase-1 、IL-1β、IL-18、ACS、NLRP3、GSDM-N末端的表達與提高PISK表達有關[19]。進一步研究發現，對已經過P2Y12受體抑制劑處理的大鼠，進行左前降支結扎再灌注前，尾靜脈注射Caspase-1的抑制劑VX-765后。結果不僅降低炎癥與焦亡相關因子的表達，而且能減少鼠的梗死面積、降低左心室重構、提高左室功能[20]。此外，有研究表明阻斷sirt1/NOX4/ROS與mToRC1信號通路,有助于減緩缺血再灌注誘導的焦亡產生[21, 22]。

4.3 細胞焦亡在糖尿病心肌病中的作用 糖尿病心肌病是糖尿病患者終末期常見的一種臨床綜合征。研究認為炎癥-焦亡在此病的進展中起重要作用。鑒于高糖是誘導炎癥體NLRP3必不可少的成分，NLRP3可能是導致糖尿病心肌病進展的一個重要原因之一[13]。對高糖誘導的二型糖尿病鼠模型進行沉默NLRP3實驗，發現基因沉默鼠心肌炎癥、纖維化、焦亡降低與心功能障礙得到一定改善[23]。此外，對高糖處理的H9C2細胞亦觀察到類似結果。此外，氧化應激產物在炎癥的激活中起關鍵作用。抑制ROS產物的聚集，不僅抑制NF-κB信號通路，而且還能降低前炎癥因子的釋放[23]。

4.4 細胞焦亡在心力衰竭中的作用 心肌梗死是導致心肌細胞死亡、心室重構、心力衰竭的主要原因。恢復冠脈的血供是挽救瀕臨死亡心肌的最佳途徑，但再灌注有時卻會加重心肌細胞損傷與死亡，稱之為再灌注損傷。再灌注后引起的炎癥反應，一方面有利于促進傷口愈合與瘢痕的形成，另一方面過度的炎癥反應會導致心肌焦亡與心室的不良重構[24]。

綜上所述，GSDM是一類具有成孔效應的家族蛋白，在導致細胞死亡中起重要作用。GSDMs家族中的五個蛋白，除去PJVK，當過表達時，其蛋白的N端均會誘導細胞焦亡。GSDME被Caspase-3水解，而部分證據表明GSDMB能被 Caspase-1/3/6/7切割，GSDME的生理作用在化療藥物引起的細胞毒性中得到證實。此外，炎癥與焦亡在心血管疾病進展中發揮重要作用。