光譜分析技術在野生食用牛肝菌研究中的應用研究進展

王圓圓，李杰慶，李 濤，劉鴻高,*，王元忠*

（1.云南農業大學農學與生物技術學院，云南 昆明 650201；2.云南省農業科學院農產品加工研究所，云南 昆明 650221；3.玉溪師范學院資源環境學院，云南 玉溪 653100）

牛肝菌科真菌（B o l e t a c e a e）隸屬真菌門（Eumycota）、擔子菌亞門（Basidiomycotina）、層菌綱（Hymenomycetes）、傘形目（Agaricales）[1]，其香氣、味道、質地獨特[2]，是世界性美味食用菌，具有重要食藥用和經濟價值。研究發現，該類物種富含蛋白質、氨基酸、礦物質元素、碳水化合物等多種營養物質[3-5]，具有抗癌、抗氧化、抗衰老、增強免疫力等功效[6-10]。可食用的牛肝菌基本屬于外生菌根菌[11]，菌根發育因素復雜，很難實現子實體人工栽培，主要依靠采集野生資源。我國是牛肝菌全球主要產區之一，年平均產量約5萬 t（鮮品），每年產季從事牛肝菌貿易多達百萬人，對地方經濟發展和人民收入水平提高有著重要貢獻[12]。

然而，野生食用牛肝菌種類繁多，種間形態相似，采用傳統感官評定難以準確鑒別，誤認、誤食、中毒事件頻繁發生[13-15]。不同產地、貯藏年限等均能導致牛肝菌子實體化學成分組成及含量產生差異，影響其品質、口感。由于牛肝菌市場供不應求，不同質量等級牛肝菌之間價格差異大，常出現以次充好，甚至出現混雜其他種類的現象[16]。此外，很多大型真菌相較綠色植物更易富集重金屬，食用過量會對人體產生毒害[17-19]，牛肝菌重金屬超標問題也因此成為人們關注的焦點。一旦難以保障質量和安全，牛肝菌產業發展將受到嚴重阻礙。由此可見，尋求牛肝菌品質鑒定與評價的可靠方法具有重要科學意義和實際應用價值。

傳統檢測產品質量的方法，有氣相色譜、液相色譜等，但存在耗時、耗力、成本昂貴、對操作人員技術要求高等問題。光譜分析技術依據被測物所含化學成分結構、含量等差異，從整體角度系統表征復雜成分體系，具有操作簡便、信息量大、特征性強等特點，廣泛應用于真菌[20-21]、食品[22-23]和中藥材[24-25]優劣、真偽判別等研究，推動著各產業持續、穩定發展。近年來，該技術逐漸應用于牛肝菌產品領域，同時分析模型準確率也日漸提高。促進了牛肝菌鑒別評價研究的發展，具有現實指導意義。本文基于紅外、紫外光譜及多光譜信息融合技術，對光譜分析技術在牛肝菌領域的研究和應用進行綜述，總結當前相關研究成果及存在的問題，以期為牛肝菌的深入研究和開發利用提供參考。

1 紅外光譜

紅外光譜通常指頻率在14 300～20 cm－1范圍內的電磁波，按波長不同分為近紅外區（0.78～3 μm）、中紅外區（3～50 μm）和遠紅外區（50～100 μm）[26]。近紅外光譜主要是有機分子中含氫基團（C—H、O—H、N—H）振動的合頻和各級倍頻和吸收，能夠對樣品進行定性定量分析[27]；中紅外光譜屬于分子基頻振動光譜，多用于定性分析[28]；遠紅外光譜為分子轉動光譜和某些基團振動光譜[29]。紅外光譜法具有簡便、無損、無污染、多組分同時測定等優點，目前主要用于牛肝菌產地溯源、物種多樣性研究等方面，是牛肝菌評價研究中最常用的光譜技術。

1.1 產地鑒別

受外界環境因素影響，不同產地牛肝菌化學成分積累不同，口感和營養價值也不盡相同。基于主成分分析，周在進等[30]分析了5 個不同縣級產地雙色牛肝菌（Boletus bicolor）傅里葉變換紅外光譜，結果顯示，除一個樣品判別錯誤，其他樣品產地均分類正確。周在進等[31]還對5 個不同產地的野生小美牛肝菌（B. speciosus）采用傅里葉變換紅外光譜進行系統聚類分析，結果表明，產地相近的樣品紅外光譜較為相似，樣品能夠按產地較好聚類，達到鑒別目的，初步證明了紅外光譜分析技術鑒別牛肝菌產地具有可行性，為后續的研究提供了依據。楊天偉等[32]研究了11 個產地美味牛肝菌（B. edulis）紅外光譜，采用正交信號校正-微波壓縮對圖譜進行預處理，同時輔以偏最小二乘-判別分析區分不同產地樣品，為牛肝菌的快速鑒別提供一種有效方法。通過多元散射校正、二階求導、Norris平滑等方法對傅里葉變換紅外光譜進行優化處理，同時結合主成分分析和聚類分析對15 個產地絨柄牛肝菌（B. tomentipes）進行鑒別，主成分分析得分和聚類分析圖顯示，樣品能夠按照產地來源聚集，可直觀顯示樣品分類情況和相關性，該方法能有效鑒別絨柄牛肝菌產地來源，分析不同產地樣品差異形成的原因[33]。除此之外，有學者采用相似的方法，將預處理后的傅里葉中紅外光譜結合化學計量學對不同來源美味牛肝菌、絨柄牛肝菌進行產地鑒別，主成分分析結果顯示，樣品按照產地聚集將兩種牛肝菌分為三大類，其中絨柄牛肝菌被分為了兩類，表明云南省美味牛肝菌比絨柄牛肝菌質量更穩定；他們認為，紅外光譜結合適當化學計量學方法是一種快速、準確的牛肝菌質量監測技術，并且有望用于其他食用菌鑒別研究[34]。

紅外光譜具有指紋特性，能夠反映樣品中復雜化學信息。地域不同導致牛肝菌中糖類、蛋白質、氨基酸等化合物的吸收峰存在差異，這些差異是區分不同牛肝菌產地的主要依據，是一種具有潛力的質量控制技術。

1.2 物種多樣性研究

牛肝菌物種豐富，外觀形態特征相近，難以直接進行準確區分。采用紅外光譜從整體化學成分角度探討牛肝菌種間差異，對牛肝菌快速辨別具有重要意義，該技術在牛肝菌物種多樣性研究方面應用最為廣泛。郭麗艷等[35]利用傅里葉變換紅外光譜法區分了銀耳、黑木耳、黑牛肝菌3 種食用菌，還通過多糖類化合物光譜特征鑒別出3 種食用菌均含α-、β-糖苷鍵，此法簡單易行，無需對樣品進行分離提取。周在進等[36]調查了雙色牛肝菌、混淆松塔牛肝菌（Strobilomyces confusus）、小美牛肝菌等9 種野生蕈菌孢子紅外光譜之間的相關性，結果顯示，孢子中脂類物質、蛋白質等較相似，多糖構型或含量差異大，實現了野生蕈菌孢子鑒別分析。選取紅外光譜特征波段作為鑒別依據，能夠過濾大量干擾信息，增加結果的可靠性。趙德璋等[37]比較了13 種牛肝菌的傅里葉變換紅外光譜，結果顯示，不同屬、種牛肝菌在1 800～750 cm－1范圍內差異明顯，同時也發現牛肝菌含有α-、β-兩種構型的多糖。相比而言，Liu Gang等[38]對6 種牛肝菌在傅里葉變換紅外光譜1 200～750 cm－1波段進行分析，樣品同樣具有上述兩種結構的多糖，依據特征波段提供的信息可以區分牛肝菌種類。二維相關紅外光譜能將光譜信號擴展到第二維以提高光譜分辨率，該方法用于牛肝菌種類鑒別時效果顯著。馬殿旭等[39]采用此法結合主成分分析對同一個屬7 種牛肝菌進行分析鑒別，結果發現，7 種牛肝菌均分類正確，采集1 680～1 300 cm－1和1 150～920 cm－1范圍的二維相關紅外光譜，根據自動鋒和交叉峰位置、數量、相對強度的差異準確鑒別7 種牛肝菌。馬殿旭等[40]還利用傅里葉變換紅外光譜結合相關性分析、二階導數和二維相關光譜對虎皮乳牛肝菌（Sinoboletus spraguei）、琥珀乳牛肝菌（Sinoboletus placidus）、綠色粉孢牛肝菌（Tylopilus virens）、類鉛紫粉孢牛肝菌（T. plumbeoviolaceoides）等13 種常見蘑菇進行研究，結果顯示，根據二階導數和二維相關紅外光譜的差異，可以對牛肝菌進行鑒別，此方法能夠為野生蘑菇分類研究提供參考。周在進等[41]采用傅里葉變換紅外光譜結合分層抽樣法探討4 種牛肝菌99 個樣品的差異性，結果顯示，原始光譜匹配正確率達98%，一階導數光譜正確率達100%，適當的數據預處理能夠提高樣品分類正確率。楊天偉等[42]利用馬氏距離和偏最小二乘-判別分析對10 種牛肝菌傅里葉變換紅外光譜進行研究，結果發現，馬氏距離能反應樣品相似性，正交信號校正-小波壓縮結合偏最小二乘-判別分析顯示，除一個華麗牛肝菌樣品，其余不同種類牛肝菌均分類正確，該研究為牛肝菌鑒別分類提供了一種輔助方法。牛肝菌種質資源豐富，分類學家對許多物種科下歸屬存在較大爭議，親緣關系分析可以對物種相似度進行比對，對物種開發利用和育種工作具有重要意義。姚森等[43]基于傅里葉變換紅外光譜研究了美柄牛肝菌（B. calopus）、黃黏牛肝菌（Suillus flavidus）、栗色牛肝菌（B. umbriniporus）等12 個不同種牛肝菌的親緣關系，通過聚類分析得到親緣關系樹狀圖，結果表明，該方法能夠分析牛肝菌親緣關系，是野生食用菌親緣關系研究的一種新方法。

根據原始紅外光譜峰形、峰位、吸收強度等能夠對不同物種進行鑒別，對于紅外光譜較相似的樣本，需要考慮對特征波段進行提取或者結合適當的光譜預處理方法消除噪音來提高鑒別準確率。

1.3 其他評價研究

紅外光譜不僅能夠用于牛肝菌產地和物種多樣性研究，在牛肝菌采收年份、干品摻假鑒別研究等方面也有所應用。楊天偉等[32]結合偏最小二乘-判別分析對2011—2014年采收的美味牛肝菌紅外光譜進行研究，結果顯示，正交信號校正-微波壓縮處理后的光譜數據能夠用于區分不同年份樣品，表明不同年份美味牛肝菌的化學成分積累具有差異，這可能與年際間氣候變化有關。另一方面，不良商販利用牛肝菌干品不易檢查的特點，對牛肝菌商品進行摻假，謀取利益，嚴重阻礙牛肝菌產業的發展。Casale等[44]采用近紅外光譜結合多元統計分析方法檢測牛肝菌干品摻假問題，結果發現，多種分類模型能將“偽品”鑒別出來，可作為一種有效的分析方法來檢驗牛肝菌產品真實性，能夠為市場在線監測提供參考。

2 紫外光譜

紫外光譜由分子中價電子能級躍遷產生，所得特征圖譜與被測物發色團和共軛結構聯系緊密，依據圖譜吸收峰位置和光譜強度能夠對化合物進行定性、定量分析[45-46]。該方法具有實用性強、靈敏度高、穩定性、重現性好等特點，其指紋特性能夠用于牛肝菌鑒別評價。

2.1 產地區分

牛肝菌營養成分及含量積累因產地不同而發生變化，根據紫外光譜指紋特性，能夠對其產地溯源進行探討。楊天偉等[47]依據9 個不同產地絨柄牛肝菌紫外光譜，輔以歐氏距離和主成分分析對樣品進行產地鑒別，結果顯示，云南楚雄南華天申堂和曲靖澤州桂花樹兩個產地樣品相似度最低，歐氏距離最大，其余樣品歐氏距離在0.26～6.52之間，主成分得分圖呈現明顯離散現象，最終達到產地鑒別目的。楊天偉等[48]還對7 個不同產地美味牛肝菌菌蓋、菌柄進行聚類分析研究，結果顯示，菌蓋、菌柄的紫外圖譜出峰位置相似，峰高具有差異，表明不同產地美味牛肝菌化學成分組成相似，含量存在差異，聚類分析將7 個產地牛肝菌分為兩大類，其中有4 個產地樣品來自接壤的云南晉寧、易門縣，表明美味牛肝菌化學成分積累與生長環境密切相關，此研究與周在進等[31]通過紅外光譜法分析不同產地牛肝菌所得結果相似。紫外光譜吸光度的高低可間接反應不同產地牛肝菌化學成分含量的差異，基于這些化學信息結合合適的分析方法可以達到區分產地的目的。

2.2 親緣關系研究

DNA相似度匹配結果分析親緣關系操作繁瑣、技術難度高。不同物種含有的化學成分不同，紫外光譜吸收峰呈現出不同的峰形及峰數。紫外光譜結合多元統計分析能快速呈現物種間親緣關系，具有重要的研究意義。Li Yan等[49]采用紫外光譜結合偏最小二乘-判別分析和聚類分析對美味牛肝菌、絨柄牛肝菌、皺蓋疣柄牛肝菌（L. rugosiceps）、絨蓋牛肝菌（Xerocomus sp.）、磚紅絨蓋牛肝菌(B. ferrugineus)進行分析，偏最小二乘-判別分析二維得分圖顯示，美味牛肝菌、絨蓋牛肝菌樣品分布較分散，5 種牛肝菌樣品完全區分；聚類分析將所有樣品正確歸類，當距離為19時，樣品被分為三大類：美味牛肝菌、絨柄牛肝菌、磚紅絨蓋牛肝菌為第一大類；第二大類為絨蓋牛肝菌；最后一類為皺蓋疣柄牛肝菌。從傳統分類角度來看，上述三大類牛肝菌分別為牛肝菌屬、絨蓋牛肝菌屬和疣柄牛肝菌屬，是否同屬牛肝菌化學信息相似、親緣關系更近，還有待進一步研究。楊天偉等[50]基于主成分分析研究了4 個不同種牛肝菌紫外光譜，主成分二維得分圖和三維得分圖顯示不同種類牛肝菌樣品出現離散現象，能夠達到鑒別目的，為食用菌鑒別提供輔助方法。

2.3 部位差異性研究

除產地和物種相關研究外，紫外光譜還能夠用于牛肝菌部位差異性研究。不同部位樣本化學特性不同，確定更有針對性的控制分析指標并加以利用，能夠為牛肝菌鑒別和市場質量控制提供更加有效的質量監控模式。基于牛肝菌不同部位紫外光譜的指紋特性，楊天偉等[51]采用紫外光譜技術結合主成分分析法，建立快速鑒別牛肝菌不同部位的方法。前3 個主成分三維得分圖顯示，不同樣品之間產生離散現象，表明牛肝菌菌蓋和菌柄的紫外光譜信息具有差異，該方法能夠用于區分同一牛肝菌不同部位。

3 多光譜信息融合

多光譜信息融合技術基于數據融合，能夠將多種儀器的數據進行優化、整合，實現儀器間的優勢互補，獲得更加全面、可靠的數據，豐富樣品信息。數據融合主要分為3 級：數據級融合、特征級融合和決策級融合。數據級融合又稱低級數據融合，直接將采集的原始數據整合，進行數據綜合分析。特征級融合即中級數據融合，首先對原始信息進行特征提取，進而對特征信息進行綜合分析和處理。決策級融合又稱為高級數據融合，其結果可為指揮控制與決策提供依據，是3 級融合的最終結果，直接針對具體決策目標，融合結果直接影響決策水平[52-53]。近年來，多光譜信息融合技術逐漸用于牛肝菌鑒別、品質評價等方面，能夠實現對數據信息進行更深入的挖掘，表現出更高的準確性，具有不可替代的地位。

3.1 產地分析

相對單一光譜分析技術，融合紅外、紫外等多光譜信息，通過各種光譜分析儀器間的協同作用，獲得更準確的分類結果，中級融合往往表現出比低級融合更高的準確性，在牛肝菌產地研究方面得到廣泛的應用。Li Yan等[54]采用傅里葉變換紅外光譜獲得9 個產地美味牛肝菌的紅外光譜，同時利用電感耦合等離子體-原子發射光譜法測定樣品中13 種元素的含量，將紅外光譜與元素含量進行中級數據融合，輔以支持向量機法鑒別9 個產地美味牛肝菌，結果發現，紅外光譜與鈉、鍶、釩、鈣、鎳、鋇、鈷、鉻、鎘9 種元素數據融合效果最好，支持向量機分類準確率最高，能夠為建立牛肝菌產地鑒別模型提供可靠依據。此外，該作者采用相似的方法，通過低級和中級數據融合對不同產地牛肝菌菌蓋和菌柄進行研究，結合支持向量機和隨機森林建立分類模型，結果顯示，菌蓋紅外光譜、菌柄紅外光譜、菌蓋元素含量、菌柄元素含量、菌蓋與菌柄元素含量商、低級數據融合、中級數據融合7 種數據矩陣性能比較，中級數據融合效果最佳，能夠作為牛肝菌產地鑒別的可靠方法[55]。基于紅外、紫外光譜技術及化學計量學，Yao Sen[56-58]、姚森[59]等對牛肝菌產地進行分析，結果發現，數據融合對產地鑒別效果顯著，優于單一光譜技術，中級數據融合較初級數據融合效果更好。在牛肝菌產地鑒別研究中，中級數據融合表現出較大的優勢，具有更高的準確性。張鈺等[60]采用紅外、紫外光譜數據融合建立牛肝菌產地鑒別模型，并對光譜融合數據進行聚類分析，結果顯示數據融合能夠提高分類準確率，進一步完善了野生食用菌產地溯源體系。Qi Luming等[61]基于電感耦合等離子體-原子發射光譜法、傅里葉變換中紅外光譜法和紫外-可見光譜法結合化學計量學研究牛肝菌不同部位和產地，通過偏最小二乘-判別分析篩選對分類貢獻較大的光譜數據，將所篩選特征變量融合后，分別建立偏最小二乘-判別分析和支持向量機分類模型，結果發現，不同產地菌蓋、菌柄具有差異，能較好區分，兩種模型均能成功用于鑒別牛肝菌產地，此外，菌蓋、菌柄所含化學信息具有差異，菌蓋數據融合模型效果優于菌柄。

3.2 種類鑒別

對于牛肝菌種類鑒別研究，Yao Sen等[62]利用傅里葉變換紅外光譜和電感耦合等離子體-原子發射光譜法進行低級和中級數據融合，鑒別不同種類牛肝菌，中級數據融合采用偏最小二乘-判別分析提取特征變量，通過支持向量機建立分類模型，結果顯示，中級數據融合區分種類效果最佳。姚森等[63]將傅里葉變換紅外光譜及紫外光譜進行數據融合，輔以偏最小二乘-判別分析模型和支持向量機模型鑒別5 種牛肝菌樣品，結果顯示，中級數據融合鑒別效果最優，偏最小二乘-判別分析和支持向量機的預測正確率分別為95.56%和100%，采用中級數據融合建立支持向量機判別模型，能有效鑒別牛肝菌種類，為牛肝菌物種鑒別和質量控制提供可靠、穩定的方法。采用相似的方法，Yao Sen等[58]通過傅里葉變換紅外光譜和紫外光譜法結合中級數據融合，建立不同產地、種類牛肝菌偏最小二乘-判別分析和網格搜索支持向量機模型，結果顯示，兩種模型用于牛肝菌地理起源和物種區分結果可靠。

3.3 貯藏年限研究

牛肝菌產品通常將新鮮子實體切成薄片后干燥保存，貯藏過程中受微生物、溫度、光照等因素影響，進而導致牛肝菌口感、風味發生變化。張鈺等[64]研究了2011—2016年6 個不同貯藏年限絨柄牛肝菌子實體，分別采用傅里葉變換紅外光譜、紫外光譜、低級數據融合、中級數據融合4 個數值矩陣結合偏最小二乘-判別分析建立模型，分類錯判數分別為10、6、4、3，中級數據融合模型效果最好。基于紅外和紫外光譜信息融合技術結合偏最小二乘-判別分析，能準確鑒別不同貯藏年限牛肝菌，為評價野生食用菌品質提供一種新思路。

3.4 食用安全性評價

微量元素在紅外光區沒有吸收峰，但重金屬一般能與有機物形成螯合物或絡合物，根據這種特殊聯系，能夠對重金屬進行定量分析。電感耦合等離子體質譜、電感耦合等離子體原子發射光譜法等評價食品安全性的方法需要對樣品進行消解，具有處理過程復雜，污染環境等缺點。紅外光譜為野生牛肝菌質量控制和食用安全評估提供快速、簡便的定性、定量分析方法[65]。目前，該技術主要針對汞、砷、鎘3 種重金屬元素進行了相關研究。楊天偉等[66]采集了15 種48 份云南常見牛肝菌紅外光譜信息，采用冷原子吸收光譜-直接測汞儀測定牛肝菌總汞含量，將牛肝菌樣品分為低（不超過1.95 mg/kg）、中（2.05～3.9 mg/kg）、高（不低于4.1 mg/kg）3 個級別，擬合預處理的牛肝菌紅外光譜數據與總汞含量數據，進行偏最小二乘-判別分析，結果顯示，不同汞含量范圍牛肝菌樣品能夠被區分，差異越大越易區分。李杰慶等[67]采用紅外光譜結合多元統計分析建立快速篩選牛肝菌砷含量是否超標的方法，通過電感耦合等離子體原子發射光譜法測定樣品中總砷含量，將優化后的12 個產地美味牛肝菌、絨柄牛肝菌紅外光譜數據與砷含量進行擬合，建立砷超標與未超標樣品的分類模型，結果顯示，不同產地、種類牛肝菌砷含量具有差異，多數牛肝菌樣品砷含量超過GB 2762—2012《食品安全國家標準 食品中污染物限量》限量標準，其中采自普洱思茅區的絨柄牛肝菌砷超標較為嚴重。楊天偉等[68]利用同樣的方法對云南不同產地、不同種類牛肝菌重金屬鎘含量進行預測，結果發現，除云南昆明五華區的灰疣柄牛肝菌外，多數樣品鎘含量超過GB 2762—2012限量標準，食用具有潛在風險，紅外光譜結合化學計量學能夠實現鎘元素含量預測，是預測牛肝菌重金屬超標、提高質量控制的一種新手段。

4 結 語

光譜分析技術具有簡便、快速、準確鑒別牛肝菌產地、種類、貯藏年限等特點。目前也存在一些缺點：光譜技術易受外界因素干擾；對樣品有效化學信息提取效率低、定量分析誤差大；分析模型通用性差；采用單一光譜技術對牛肝菌進行評價仍顯不足。多光譜信息融合能夠利用光譜之間優勢互補的特點，提高鑒別和評價準確性，但是對于牛肝菌特有成分尤其是香氣成分的量化分析仍無法全面實現。光譜分析技術主要針對牛肝菌產地、種類、貯藏年限等方面進行鑒別和評價，不能對牛肝菌所含化學成分做出綜合、全面的評價，沒有充分發揮光譜技術的應用范圍。光譜分析技術除紅外、紫外光譜外，還包括熒光光譜、拉曼光譜等，多光譜信息聯用對牛肝菌進行綜合評價研究，是改善現有光譜技術缺陷的重要途徑。評價指標的選擇、方法的優化、模型的穩定性仍是后期需要著力解決的問題。光譜技術與色譜等指紋圖譜的有機結合，增加了評價參數，為完善牛肝菌質量控制體系提供了技術支持，同時也為我國真菌產業持續穩定發展提供科學依據。牛肝菌具有的特異性芳香成分無法全面量化分析，結合氣相色譜-質譜對風味成分進行分離和鑒定，彌補光譜技術的缺陷，能夠為全面評價牛肝菌品質提供新的途徑。