IL36RN基因突變與掌跖膿皰病的相關性研究

付芳惠 付希安 王真真 于功奇 劉 紅 張福仁

IL36Ra是IL-36α、IL-36β及 IL-36γ的受體拮抗劑，通過與IL-36受體結合抑制核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB) 信號通路及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK) 途徑下游促炎信號的活化[1]。自2011年Marrakchi等人首次報道IL36RN突變導致IL-36Ra的功能減弱或喪失，引起泛發性膿皰型銀屑病(GPP)的發生后，多項遺傳學研究發現其突變具有種族異質性[1-4]。隨后，有學者對IL36RN與局限性膿皰型銀屑病的相關性進行討論，包括掌跖膿皰病(palmoplantar pustulosis，PPP)和連續性肢端皮炎(acrodermatitis continua of Hallopeau，ACH)[5]。PPP是一種局限于掌跖部位的慢性炎癥性皮膚病，臨床表現為紅斑基礎上周期性發生的無菌性膿皰，伴角化、鱗屑。目前，關于IL36RN與PPP的相關性存在爭議。M?ssner等[6]發現在歐洲人群中IL36RN與PPP不相關。日本學者對88例PPP患者的IL36RN基因測序報道了相似的結果[7]。然而，在14例中國PPP中發現2例患者攜帶c.115 + 6T>C突變[2]。為進一步明確IL36RN與中國人群PPP的相關性，我們收集了96例PPP患者和144名健康志愿者，對其進行了IL36RN基因測序，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 為2014年1月至2017年12月在我院就診的96例PPP患者和144名健康志愿者。病例組和對照組的平均年齡分別為(51.23±11.94)歲和(50.05±11.12)歲。病例組的男女比例為1∶3，對照組為5∶11。兩組之間年齡和性別差異均無統計學意義。所有患者由我院2名經驗豐富的皮膚科專家根據臨床表現和組織病理確診。本研究得到了山東省皮膚病性病防治研究所倫理委員會的批準。所有參與者均簽署知情同意書。

1.2實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 用EDTAK2抗凝管抽取5mL外周靜脈血，根據TGuide大體積血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)操作步驟提取外周全血DNA。使用全波長紫外/可見光掃描分光光度計ND-8000(NanoDrop公司)測定DNA濃度及純度，根據DNA原液濃度將DNA原液標化為30 ng/μL的DNA模板。

1.2.2 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)擴增 使用NCBI(National Center of Biotechnology Information)/Primer-BLAST對IL36RN(參考號NM_012275.2)全部外顯子及其兩端側翼序列設計擴增引物，由北京華大基因研究中心合成，引物序列詳見表1。PCR采用12.5μL反應體系：Taq Mix(包括dNTP、Taq酶和緩沖液)6.5μL，滅活的去離子水ddH2O 5μL，上下游引物(F+R)0.5μL，模板DNA 0.7 μL。反應條件:94℃預變性10 min：94℃變性30 s，退火45s(退火溫度詳見表1)，72℃延伸1 min，共35個循環；最后72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物。

1.2.3 DNA測序 采用乙醇醋酸鈉純化法純化所有陽性擴增條帶的樣本。分離純化后的DNA采用雙脫氧鏈終止法(Sanger測序法)，在ABI 3500XL DNA測序分析儀(美國Applied Biosystem公司)上進行基因測序。用Chromas軟件對測序結果進行分析，并將測序結果與NCBI下載的參考序列同時輸入NCBI Nucleotide BLAST中進行比對分析。

1.3 統計學方法 數據分析采用SPSS軟件包22.0版本處理。除了描述性數據，定量資料若符合正態分布，以(均數±標準差)表示，若不符合，則以中位數和四分位間距(IQR)表示或百分比(頻率)表示。定性資料采用Pearson’s卡方檢驗或Fisher’s精確檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料 本研究共包括96例PPP患者，其中男24例，女72例，男女比例為1∶3 ，平均發病年齡為(49.53±12.07)歲。

2.2 IL36RN測序結果 對96例PPP患者和144名健康對照者進行IL36RN基因測序，共檢測到2個已知的突變位點：c.115+6T>C(p.Arg10ArgX1)雜合突變和c.140A>G(p.Asn47Ser)雜合突變。見圖1。96例PPP患者中有6(6.3%)例患者攜帶突變，其中3例患者攜帶c.115+6T>C， 3例攜帶c.140A>G。144名健康對照者中共有6(4.2%)名攜帶突變，2名攜帶c.115+6T>C，4名攜帶c.140A>G。PPP組與健康對照組IL36RN突變率比較,差異無統計學意義(P=0.67，OR=0.65，95%CI:0.20～2.09)。

圖1 a：c.115+6T>C 雜合突變；b：c. 140A>G 雜合突變

外顯子引物序列5’-3’退火溫度(℃)片段大小(bp)2上游5-’CTCAGCCTCTCTCTCCATGATT-3’下游5’-CGGGTCTATCCAGAACTCACTT-3’581643上游5’- TGCTGTTACTTCTGGCACAGT-3’下游5’-CCAAGGAAAGTGGGTCATGT-3’582494上游5’-CTGCTGAGAAGCCTCCCTTC-3’下游5’-CTGAGTCCCCAGTGAGGATG-3’582935上游5’-GATTCTGTTGATGGCAGCTTT-3’下游5’-CATGGGTCTCCTCCACTCAC-3’58396

3 討論

PPP是一種以掌跖部位反復發生無菌性膿皰為特征的炎癥性皮膚病，好發于中老年女性，其發病率為0.05%～0.1%[8]。本研究中PPP平均發病年齡為(49.53±12.07)歲，女性是男性的3倍，與之前的文獻報道相似[9]。

PPP的病因和發病機制尚不清楚，研究證實遺傳因素在疾病的發生發展中發揮重要作用[10]。由于PPP和GPP同屬于膿皰型銀屑病，因此有學者把GPP的致病基因在PPP中進行驗證。2011年Marrakchi等利用純合子定位和直接測序法對9個GPP突尼斯家系進行研究，發現IL-36RN是常染色體隱性遺傳GPP的致病基因。IL36RN屬于IL-1家族，主要在皮膚中表達，編碼 IL36受體拮抗劑(IL36-Ra)。IL36-Ra通過與IL-1受體樣2受體(IL-1RL2)結合，參與激活促炎癥信號NF-κB及和MAPK信號轉導通路，阻礙IL-36細胞因子(IL-36α、IL-36β、IL-36γ)炎癥作用。當IL36RN發生突變時，其編碼的IL-36Ra結構發生改變，對 IL-1RL2的拮抗能力減弱甚至喪失，而IL-36α、IL-36β、IL-36γ與IL-1RL2的結合則相應增加，通過激活下游促炎癥信號通路，最終引起皮膚的炎癥反應[1，11]。2013年Setta-Kaffetzi等在139例歐洲PPP患者中發現7例攜帶IL36RN突變，證實PPP與IL36RN相關[5]。2015年M?ssner的研究團隊對251例歐洲PPP患者進行IL36RN基因的篩查，檢測到4例患者攜帶突變。雖然基于Setta-Kaffetzi等研究的等位基因頻率和效應量，該研究有大于99.999%的效能來檢測PPP與IL36RN突變等位基因之間的關聯，但是其研究并沒有得到IL36RN突變與PPP發病相關的證據支持[6]。隨后，日本團隊也報道IL36RN突變不是PPP的決定性致病因素[7]。然而，有學者在14例中國PPP中發現2例患者攜帶c.115 + 6T>C突變[2]。為進一步明確IL36RN與中國人群PPP的相關性，我們對96例中國漢族PPP患者和144名健康對照進行IL36RN測序，發現PPP組與健康對照組IL36RN突變率相比,差異無統計學意義(P=0.67，OR=0.65，95%CI:0.20～2.09)。本研究中PPP組和正常對照組中c.140A>G的突變等位基因頻率分別為0.015和0.013。在人類遺傳變異數據庫( Human Genetic Variant Database)的1142個樣本中共50個攜帶c.140A>G雜合突變，突變等位基因頻率為0.022。PPP組與二者相比，差異均無統計學意義，因此我們認為此突變與PPP不相關。c.115 + 6T>C是亞洲人群中最常見的突變，位于IL36RN基因3號外顯子下游的內含子區域，突變影響3號外顯子的剪接，導致截短蛋白的合成，影響IL36Ra的功能[12]。我國臺灣學者曾報道此突變與PPP相關，其OR值為15.8[2]。本研究在96例PPP患者中發現3例攜帶c.115+6T>C，基于臺灣學者研究中的等位基因頻率和效應量，我們有88.76%的效能檢測突變與PPP的相關性。我們的研究并不支持IL36RN基因與PPP發病相關，與歐洲、日本的研究結果一致。