基于基因芯片技術探究柴樸湯對哮喘大鼠差異表達基因的調控

， ，，韶澤， ，

南華大學附屬第一醫院,1.呼吸內科, 2.中醫科, 湖南 衡陽 421000)

支氣管哮喘(Bronchial Asthma)是由多種原因共同作用引起的常見病，主要受到遺傳因素和環境因素的共同影響，一直是呼吸道疾病研究的熱點，但其發生發展的生物學機制及調節機制仍未明確[1]。傳統中藥治療哮喘有多種方法，其作用溫和且副作用少，不僅可控制哮喘的急性發作，對于患者的遠期愈后也具有十分重大的意義。柴樸湯作為治療哮喘的常用方劑，其療效已經得到臨床驗證，但其控制哮喘發作的機制尚不明確?；诖?，本研究以哮喘大鼠為實驗對象，采用基因芯片技術，在基因水平探究柴樸湯控制哮喘大鼠急性發作及后期修復的作用機制，為柴樸湯的臨床用藥，提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康SPF級SD大鼠18只，雄性，體重(200±20)g，南華大學動物實驗部提供。

1.1.2 藥物和試劑 卵蛋白(OVA)購自美國Sigma公司(Ⅱ級)；中藥配方顆粒購自廣東一方制藥有限公司；Trizol、瓊脂糖、EB、TBE購自Invitrogen公司；dNTP、RNase Inhibitor、M-MLV 購自Takara公司；RNA提取試劑盒購自東盛生物技術股份有限公司;PCR引物購自江蘇聯川生物技術有限公司；Phalanx Rat OneArray基因芯片購自臺灣華聯生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及造模 18只健康SD大鼠適應性喂養2周后，按隨機數字表法分3組，即正常組、哮喘組及柴樸湯干預哮喘組，每組6只。哮喘造模于第1天與第8天，腹腔注射1 mg卵蛋白加100 mg氫氧化鋁配成1 mL生理鹽水混懸液，第15天開始，以1%卵蛋白霧化吸入，隔天1次，連續7次，每次持續30分鐘。柴樸湯干預哮喘組每次霧化前半小時予以柴樸湯2 mL灌胃；哮喘組予以生理鹽水2 mL灌胃；正常組給予生理鹽水1 mL致敏、霧化，2 mL生理鹽水灌胃作為對照。

1.2.2 肺泡灌洗液炎癥相關細胞計數 取左側肺組織行嗜酸性粒細胞(Eosinophils，EOS)和白細胞(White blood cell, WBC)計數，以生理鹽水行肺泡灌洗，收集灌洗液離心(2000 r/min離心20min)，回收細胞，油鏡下計數瑞士染色后細胞的數量。

1.2.3 HE染色 造模成功后，采用腹主動脈放血法處死大鼠，取大鼠肺組織，以10%的甲醛溶液固定，行HE染色，光鏡下分析肺組織的病理變化。

1.2.4 基因芯片試驗及分析 肺組織RNA提取后，基因表達分析使用 Phalanx Rat One Array 基因芯片，用激光共聚焦掃描儀對雜交后的芯片進行掃描，同時扣除背景雜交信號值，每組樣品均需行重復實驗。

1.2.5 熒光定量PCR檢測 使用Real-Time PCR檢測肺組織MAL及TPD52的表達，待反應結束后收集所有反應體系中目的基因的初始表達量。將每組目的基因的CT值，與標準曲線對應的CT值對照，得到MAI基因及TPD52L基因的相對表達量。

2 結 果

2.1 柴樸湯對肺泡灌洗液中EOS及WBC數量的影響

與正常組對照，哮喘組中EOS及WBC的數目增多; 與哮喘組對比，柴樸湯干預組中上述炎性細胞數目均顯著降低(見表1)。

表1 各組BALF中嗜酸性粒細胞及白細胞數量

2.2 柴樸湯對哮喘大鼠肺組織病理改變的影響

肺組織HE染色后可見：正常組肺泡壁結構完整，管壁無增厚，管腔未見狹窄，周圍僅少量炎性細胞浸潤；哮喘組可見管壁增厚明顯，管腔狹窄，可見大量炎性細胞浸潤；柴樸湯干預后，管壁增厚不如哮喘組明顯，炎性細胞的浸潤也明顯下降(見圖1)。

2.3 基因芯片雜交結果

芯片掃描后顯示顯示信號強度均勻，基因點清晰。一個基因的表達由一個熒光亮點表示，亮度越高、數量越多，代表表達量越高(見圖2)。

圖1 柴樸湯對哮喘大鼠肺組織的影響

圖2 基因芯片掃描圖

2.4 熒光定量PCR分析結果

哮喘組MAL基因的表達顯著低于正常組，在柴樸湯干預后，可見其出現上調；在哮喘組中TPD52L基因表達較正常組顯著升高，柴樸湯干預后，其表達發生下調(見表2)。

表2 各組差異表達基因的熒光定量PCR結果與基因芯片結果對比

3 討 論

本課題組前期通過基因芯片技術，篩選出與哮喘致病密切相關的MAL及TDP52L1基因，從整體分子學水平研究哮喘發病的病因及可能的病理生理機制[2]。

MAL為T-淋巴細胞相關蛋白，是一種主要表達于細胞表面的頂端膜蛋白，可參與上皮細胞的分泌與吸收[3]。同時，也有研究發現Mal可作為囊泡形成與運輸相關蛋白，調節頂端膜物質的轉運和分泌，通過維持上皮細胞極性，調節多種疾病的發病過程，其分布狀態的改變及表達量的下調，可影響正常細胞極性，介導細胞的炎癥反應[4-5]。本課題組在在前期哮喘大鼠模型中也發現，隨著哮喘炎癥反應的進展，MAL基因呈明顯的下調趨勢。TPD52L1是癌蛋白52(D52)家族成員之一。TPD52L1的基因擴增與病毒轉染的細胞增殖及腫瘤細胞的增生都密切相關[6]。Proux V證實逆轉錄病毒轉導的TPD52L1能夠促使雞的神經膠質上皮細胞增生, 又證實了D52家族基因表達介導細胞的增生[7-8]，結合前期基因芯片技術發現TPD52L1在肺組織中的表達隨著哮喘病程的進展逐漸上調，據此推測TPD52L1通過參與上皮細胞的增生，影響哮喘疾病的進展。

氣道炎癥及氣道重塑是組成哮喘病理變化的兩大基石，但目前其治療仍是以抑制炎癥的糖皮質激素為主，這對改善患者的氣道重塑效果差且副作用多，所以急需尋找一種既無明顯副作用又可以長期應用，同時擁有良好平喘作用的藥物。柴樸湯是針對哮喘病理機制而設的方劑，該方可顯著的抑制疾病變態反應并有鎮咳、鎮靜、解痙、抗炎、祛痰、和增強非特異性抗感染免疫功能的作用[9-10]。作為治療哮喘的常用方劑，柴樸湯治療哮喘的臨床療效已經得到充分證實[11]。本研究通過基因芯片及實時定量PCR結果分析，發現柴樸湯可上調MAL基因及抑制TPD52L1基因在肺組織中的表達，減輕哮喘氣道炎癥及重塑的程度，結合本實驗結果及相關文獻，筆者推測柴樸湯可能通過影響MAL及TPD52L1在肺組織氣道上皮細胞中的表達，維持氣道上皮組織功能，阻斷上皮組織細胞增殖，進而抑制哮喘氣道炎癥及重塑的進程。