光譜指紋定量法評價木香順氣丸質量

王玲嬌 ，孫國祥 ，戴 娜 ，楊繼章 ，于 靜

（1.河北醫科大學第一醫院，河北 石家莊 050031； 2.沈陽藥科大學藥學院，遼寧 沈陽 110016；3.河北省直屬機關第二門診部，河北 石家莊 050000）

木香順氣丸由木香、砂仁、香附（醋制）、檳榔、甘草、陳皮、厚樸（制）、枳殼（炒）、蒼術（炒）和青皮（炒）10 味中藥組方，傳統劑型為水丸，收載于2015年版《中國藥典（一部）》[1]。其具有行氣導滯、燥濕健脾等功效，常用于治療食積、腹痛、氣郁等癥[2]。藥典收載的質量標準為用高效液相色譜（HPLC）法測定厚樸酚含量，現有文獻報道了厚樸酚的HPLC指紋圖譜[3]和甲醇提取物的指紋圖譜[4]，也有文獻報道橙皮苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內酯等單個或多個成分的含量[5-8]。紫外指紋圖譜可反映中藥中具有不飽和化學鍵及其共軛體系基本物質的吸收情況，并以此控制中藥質量[9-10]。紅外指紋圖譜不僅可反映中藥中多種化合物成分飽和鍵的吸收，且樣品預處理簡單，無須行樣品損壞檢測[11]。可通過適當校正樣本建立數學模型，應用優化后的數學模型和未知樣品的近紅外光譜[12-13]，進行中藥質量控制。本研究中利用中藥紅外-紫外光譜（IR-UV）聯用技術[14-15]建立木香順氣丸的光譜指紋圖譜，結合光譜指紋定量法宏觀定性定量評價木香順氣丸的質量，進而實現其質量控制。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀（含DAD檢測器、四元低壓梯度泵、在線脫氣和自動進樣裝置及Chem-Station工作站，美國Agilent公司）；KDM型控溫電熱套（山東鄄城華魯儀器公司）；BS110S型分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；RE-52型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；Bruker IFS55型紅外分光光度儀（瑞士布魯克公司）。

1.2 試藥

16批木香順氣丸樣品來源見表1。甲醇（色譜純，山東禹王實業有限公司禹城化工廠），其他試劑均為分析純，水為去離子水。

表1 木香順氣丸廠家、批號及劑型

2 方法與結果

2.1 分析條件

2.1.1 UV 光譜條件

光譜管：Agilent聚四氟乙烯（PTFE）管（600 mm ×0.17 mm）；柱溫：（30.0 ±0.15）℃ ；流動相：甲醇 -水（50 ∶50， V／V）;流速:0.5 mL ／min;進樣量:0.1 μL;檢測波長:220～450 nm（DAD），數據采集間隔 0.5 nm，狹縫寬度1 nm。

2.1.2 IR 光譜條件

波段：4 000 ～ 400 cm-1；分辨率：8 cm-1；掃描速率：20 次 ／s；升溫速率：2 ℃ ／min。

2.2 供試品制備

UV光譜：取樣品約6 g，精密稱定，加入75%乙醇50 mL回流提取1.5 h，濾過，殘渣重復濾過1次，殘渣中再加入95%乙醇40 mL回流1 h。合并3次濾液，減壓濃縮至約10 mL，然后用95%乙醇定容至25 mL，搖勻，作為供試品溶液。

IR光譜：取樣品 2丸，研磨成粉末，取1～2 mg，精密稱定，精密稱取150 mg干燥的KBr粉末，研磨、混勻，轉移至模具中，在低真空下用約10 GPa的壓力，經約2 min即可將樣品壓成透明供試品薄片，精密稱定質量，于10 min內測試。

2.3 IR-UV光譜定量法原理

選擇一固定對照模式（至少平均生成10批樣品，也可選用指紋對照品）作評價標準，分別以IR和UV光譜各數據點為基礎，分別按公式(1)(2)(3)計算樣品的IR和UV光譜與標準光譜間的宏定性相似度(Sm)、宏定量相似度(Pm)、均化系數相對偏差(α)；對IR和UV指紋圖譜反映的兩類宏觀定性定量信息進行等權融合，計算公式見（4)(5)(6），據此建立中藥IR-UV聯用指紋系統等權融合模型。中藥IR光譜和UV光譜突出反映了兩類宏觀定性定量信息，IR光譜能檢測單鍵信息，可補償UV光譜僅能檢測不飽和鍵的不足。這一方法構成了基于中藥整體系統化學鍵振動和價電子躍遷的光譜指紋定量法，反映的整體定性定量信息明顯好于任何單一色譜指紋圖譜和單一光譜指紋圖譜，稱為中藥IR-UV聯用光譜指紋定量法。據此將中藥質量劃分為8個等級（見表2）。

2.4 指紋圖譜的建立和評價

2.4.1 UV 光譜指紋圖譜

1)方法學考察

精密度試驗：取編號為S1的樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液1份，按2.1.1項下檢測條件連續進樣6次，以265 nm波長處木香順氣丸非分離色譜圖考察進樣精密度。結果其保留時間和峰面積的 RSD均小于0.3%（n＝6），表明方法精密度良好。

表2 中藥IR-UV聯用系統指紋定量法劃分中藥質量等級

穩定性試驗：取編號為S1的樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液 1 份，分別于 0，2，4，8，12，24 h 時按2.1.1項下檢測條件進樣測定，以265 nm波長處木香順氣丸非分離色譜圖考察穩定性。結果保留時間和峰面積的 RSD 分別小于 1.0% 和 3.0%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗：取編號為S1的樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液6份，按2.1.1項下檢測條件進樣測定，以265 nm波長處木香順氣丸分離色譜圖考察重復性，結果保留時間和峰面積的 RSD分別小于1.0%和3.0%（n＝6），表明方法重復性良好。

2)圖譜建立

將16批木香順氣丸分別進樣檢測，記錄220～450nm波長處的在線UV光譜，詳見圖1。考慮到流動相中甲醇和提取溶劑中乙醇的末端吸收，又由于波長在450 nm后制劑成分基本無吸收，因此確定220～450 nm波長用于鑒定其不飽和成分的含量情況。將樣品信號導入自主研發的中藥光譜指紋圖譜超信息特征數字化評價系統3.0軟件，以各數據點為計量單元按均值法生成對照指紋圖譜，并根據系統指紋定量法計算各樣品 Sm-UV，Pm-UV，αUV值。結果見表 3。

3)圖譜整體質量評價（系統指紋定量法）

圖1 16批木香順氣丸的紫外指紋圖譜

由表3可知，質量等級從Ⅰ級到Ⅴ級分布，來自6個廠家的16批樣品的質量出現明顯差異，S3，S5，S10為Ⅰ級，質量極好；S8和S14為Ⅴ級，質量為中等。所有樣品 Sm-UV≥0.993，73.1% ≤ Pm-UV≤127.8% ，0.001≤αUV≤0.057，說明16批樣品UV指紋數量和分布比例較相似，但整體含量仍有差異，大部分樣品質量等級介于Ⅰ～Ⅲ級，僅S8和S14質量等級為Ⅴ級，究其原因，主要為 Pm-UV值的顯著差異，S8 Pm-UV值過高（127.8%），S14 Pm-UV值過低（73.1%），導致這2批次的質量等級為Ⅴ級。除此之外，來自同一生產廠家的藥品質量一致性略有差異，個別廠家甚至差異很大，如 S5，S6，S12（山東三九藥業有限公司）質量等級相同或相似，分布在Ⅰ級和Ⅱ級；S8，S9，S16（廣州中一制藥有限公司）樣品質量等級分別為Ⅴ級、Ⅲ級和Ⅱ級。

2.4.2 IR 指紋圖譜

1)方法學考察

精密度試驗：取編號為S1的樣品，按2.2項下方法制備供試品1份，按2.1.2項下檢測條件連續進樣6次，記錄光譜圖，導入中藥光譜指紋圖譜超信息特征數字化評價系統 3.0 軟件。結果 SIR≥0.990 且 RSD ＝0.23%（n＝6），表明方法精密度良好。

表3 UV、IR及UV-IR鑒定16批木香順氣丸藥材質量等級

穩定性試驗：取編號為S1的樣品，按2.2項下方法制備供試品 1 份，分別于 0，1，2，3，4，6 h 時按 2.1.2 項下檢測條件進樣測定，記錄光譜圖，導入同一軟件。結果SIR≥0.990且 RSD ＝0.15%（n＝6），表明供試品溶液在6 h內穩定性良好。

重復性試驗：取編號為S1的樣品，按2.2項下方法平行制備供試品6份，按2.1.2項下檢測條件進樣測定，記錄光譜圖，導入同一軟件，結果 SIR≥0.990且RSD ＝0.36%（n＝6），表明方法重復性良好。

2)圖譜建立

將16批樣品分別進行IR光譜檢測，記錄400～4 000 nm波長處的中藥IR光譜，詳見圖2。將樣品信號導入同一軟件，以各數據點為計量單元按均值法生成對照指紋圖譜，并根據系統指紋定量法計算各樣品 Sm-IR，Pm-IR和 αIR值。結果見表3。

圖2 16批木香順氣丸紅外光譜圖

3)圖譜整體質量評價（系統指紋定量法）

由表3可知，各個樣品之間質量差異很大，質量等級最好為Ⅰ級，最差的達Ⅷ級，S1，S3，S5，S6，S16 為Ⅰ級；S10 和 S13 為Ⅱ級；S9，S14，S15 為Ⅲ級；S4，S8，S11為Ⅳ級；S2和 S7為Ⅴ級；S12為Ⅷ級。所有樣品Sm-IR≥0.983，71.6% ≤ Pm-IR≤164.6% ，0.001≤αIR≤0.074，說明16批樣品IR指紋數量和分布比例相似，但指紋整體含量存在顯著差異。S12因 Pm-IR值過高（164.6%），未達到合格要求；而S2因 Pm-IR值過低（71.6% ），質量評價為中等。

2.4.3 IR-UV聯用評價木香順氣丸質量

根據公式(4)(5)(6)對UV指紋圖譜和IR指紋圖譜分析結果進行整合，用光譜指紋定量法鑒定16批木香順氣丸質量。結果見表3。16批樣品 Sm-IRUV≥0.991，表明16批木香順氣丸的化學成分的種類和分布比例十分相似。S3，S5，S6，S8，S9，S10，S15，S16 質量為極好（Ⅰ級），S1 和 S7 質量為很好（Ⅱ級），S2，S4，S11，S13，S14質量為好（Ⅲ級），S12質量為中等（Ⅴ級）。

2.4.4 不同分析方法評價結果比較

由圖3可知，16批樣品在不同分析方法下的質量等級評定結果不同。如S12在UV光譜指紋圖譜、IR光譜指紋圖譜和整合法時質量等級分別為Ⅱ級、Ⅷ級和Ⅴ級。采用IR和UV指紋圖譜分別計算16批木香順氣丸的 Sm均不低于0.99，2種方法均證明，各批樣品化學成分種類和分布比例都十分相似，由于IR和UV光譜檢測原理的顯著不同，導致宏定量相似度 Pm差異很大。上述不同分析方法的定量相似度見圖4。

圖3 不同評價方法得到的樣品質量等級

圖4 不同評價方法得到的樣品定量相似度結果

3 討論

中成藥化學成分非常復雜，單一地采用UV或近IR分析技術分析時，并不能真實全面地反映中藥的質量。本研究中以IR檢測單鍵信息，以彌補UV僅能檢測不飽和鍵的不足，實現了IR-UV聯用對木香順氣丸進行整體定性和整體定量的快速鑒定，基于光譜學的簡單、快捷并在多組分未分離的情況下得到整體的數據來區別中成藥的質量等級，試圖全方位、多角度揭示中藥復雜的特征，為其質量控制提供新思路。由于中藥信息的量大及不確定性可能會使制劑的質量等級在不同分析方法中發生較大差異，多種分析方法的聯合或許能進一步縮小誤差，從而使試驗結果更接近中藥的真實質量。但光譜指紋圖譜不能揭示藥物確定的有效成分，也不能解釋生物活性成分和質量等級的相關性，因此結合中藥的藥效學構建更全面的定性定量光譜指紋學的質控模型得進一步研究。