表面活性劑-超聲協(xié)同提取紅景天總黃酮工藝優(yōu)選

洪松彬 ，何石蘭 ，黃海潮 ，聶 陽

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405； 2.廣東省中醫(yī)院二沙島分院，廣東 廣州 510105；3.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520）

紅 景 天 Rhodiola crenulata（Hook.f.et Thoms.） H.Ohba為薔薇目景天科多年生植物，其根莖粗壯且略帶芳香，是主要入藥部位[1]，具有扶正固本、理氣養(yǎng)血的功效，主治氣虛血瘀、氣短乏力、倦怠氣喘等氣虛證。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有改善心肺功能、促進(jìn)血管生長、保護(hù)缺氧心肌、改善急性腦梗死狀態(tài)等作用[2-4]。黃酮類化合物是紅景天中主要活性成分之一，包括山柰酚、草質(zhì)素苷、槲皮素、花色苷等[5]。黃酮類化合物一般以水溶性苷或脂溶性苷元2種形式存在，由于苷與苷元的極性相差較大，傳統(tǒng)提取方法如水煎煮法、回流法、酶解法、超聲法和微波法均難以同時(shí)提高兩類成分的提取率[6]。表面活性劑提取是近年興起的中藥提取法，利用其增溶作用，可增加藥材中苷元等脂溶性成分的溶解度，從而大大提高低極性成分的提取率[7]。本試驗(yàn)中采用表面活性劑-超聲協(xié)同提取法，通過正交試驗(yàn)優(yōu)選紅景天總黃酮的提取工藝參數(shù)，為在工業(yè)化生產(chǎn)中引進(jìn)高效、經(jīng)濟(jì)的中藥提取方法提供參考。

1 儀器與試藥

儀器：UV-1800型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；SB-5200DTD型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；D101型大孔樹脂（天津波鴻樹脂科技有限公司）。

試藥：蘆丁對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100080-201708，純度≥99%）；紅景天飲片（廣東康美藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為180120361）；試驗(yàn)所用試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材處理流程及提取方法

紅景天清洗→干燥→粉碎→過80目篩→密封保存→稱取適量紅景天粉末（5 g）→加入乙醇和1.0%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液→超聲提取→回收溶劑濃縮粗提物→抽濾去除藥材碎渣→大孔樹脂柱純化→微孔濾膜濾過不溶性顆粒→取上清液（即為供試品溶液）→檢測(cè)。

2.2 紅景天總黃酮的相關(guān)測(cè)定

測(cè)定波長選擇：以蘆丁為對(duì)照品，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法測(cè)定總黃酮含量。稱取蘆丁對(duì)照品10.80 mg，精密稱定，以70%乙醇溶解并定容至50 mL，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.216 g／L的對(duì)照品溶液。分別吸取對(duì)照品溶液和2.1項(xiàng)下供試品溶液適量，各置25 mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加 10%Al（NO3）3溶液 1.0 mL，搖勻，放置 6 min，加入4%NaOH溶液 10.0 mL，用70%乙醇定容，搖勻，放置15 min。以70%乙醇為參比液，在300～700 nm波長區(qū)間掃描。結(jié)果對(duì)照品溶液和供試品溶液在510 nm波長處均有最大吸收，故選取510 nm為測(cè)定波長。

提取率計(jì)算：準(zhǔn)確量取蘆丁對(duì)照品溶液 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，分別置 25 mL 容量瓶中，于510 nm 波長處測(cè)定吸光度。以質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝0.012 4 X＋0.003 57，r＝0.999 4(n＝7)。結(jié)果表明，蘆丁質(zhì)量濃度在 5.417 ～55.282 μg／mL 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。精密度和24 h穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果的 RSD 分別為 1.10% 和 0.92% （n＝6）；加樣回收率為 98.58% ，RSD ＝1.50%(n＝6）。取供試品溶液適量，依法操作，測(cè)定510 nm波長處吸光度，計(jì)算總黃酮質(zhì)量濃度，并按公式計(jì)算提取率。提取率（%）＝[K×cx× V／（106× m）]×100% ，式中，K 為稀釋倍數(shù)，cx為供試品溶液中總黃酮質(zhì)量濃度（μg／mL），V為供試品溶液體積（mL），m 為紅景天飲片質(zhì)量（g）。

2.3 表面活性劑篩選

稱取6份藥材樣品粗粉各5.00 g，置燒瓶中，加10倍量70%乙醇，分別加入體積分?jǐn)?shù)為1.0%的不同親水疏水平衡值（HLB）的表面活性劑，超聲（功率為500 W）提取1 h，濾過后得供試品溶液。按2.2項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮提取率，結(jié)果見表1。陰離子表面活性劑的加入可顯著提高總黃酮的提取率，其中以SDS效果最好，可能是SDS形成的膠束更有利于黃酮的增溶[8]。故選用SDS作為表面活性劑。

2.4 單因素試驗(yàn)

稱取6份藥材樣品粉末各5.00 g，試驗(yàn)條件為按料液比1∶10(g∶L)加入70%乙醇作為溶劑，加入SDS至終體積分?jǐn)?shù)為1%，超聲提取15 min。

SDS濃度選擇：分別加入SDS至終體積分?jǐn)?shù)依次為0.5% ，1.0% ，1.5% ，2.0% ，2.5% ，3.0% ，平行提取 3次，按2.2項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮含量并計(jì)算其提取率，結(jié)果見圖1。可見，隨著SDS體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮提取率也逐漸升高，在SDS體積分?jǐn)?shù)為1.5% 時(shí)，總黃酮提取率最大，再增加SDS體積分?jǐn)?shù)，總黃酮提取率不再升高，故SDS的體積分?jǐn)?shù)應(yīng)在1% ～2%范圍進(jìn)行優(yōu)化。

超聲功率篩選：將超聲功率分別設(shè)為 300，400，500，600，700，800 W，平行提取 3 次。按 2.2 項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮含量并計(jì)算其提取率，結(jié)果見圖2。可見，超聲功率在300～600 W范圍內(nèi)總黃酮提取率逐漸升高，當(dāng)功率超過700 W后，總黃酮提取率顯著降低。其原因?yàn)槌暪β蔬^大時(shí)，高頻振動(dòng)產(chǎn)生的熱效應(yīng)使溫度升高，導(dǎo)致熱穩(wěn)定性較差的黃酮類成分含量減少，故應(yīng)在500～700 W范圍內(nèi)對(duì)超聲功率進(jìn)行優(yōu)化。

提取時(shí)間篩選：分別超聲提取 5，10，15，20，25，30 min，平行提取3次，按2.2項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮含量并計(jì)算其提取率，結(jié)果見圖3。可見，隨超聲時(shí)間的延長，總黃酮提取率逐漸升高，在15～20 min時(shí)總黃酮提取率最高，繼續(xù)延長時(shí)間，總黃酮提取率反而降低。這可能是因超聲波具有較強(qiáng)的熱效應(yīng)，過長時(shí)間作用會(huì)破壞黃酮類成分，故應(yīng)在15～25 min范圍內(nèi)對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

表1 表面活性劑種類對(duì)總黃酮提取率的影響

圖1 SDS體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響

圖2 超聲功率對(duì)總黃酮提取率的影響

圖3 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)篩選：分別以體積分?jǐn)?shù)為40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇作為溶劑進(jìn)行提取，平行提取3次，按2.2項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮含量并計(jì)算其提取率，結(jié)果見圖4。可見，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮提取率逐漸升高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)總黃酮提取效率最高，而乙醇體積分?jǐn)?shù)大于70%時(shí)總黃酮提取率開始下降。這是因黃酮大多以苷的形式存在于藥材中，其水溶性較好，當(dāng)乙醇和水達(dá)到適合的比例時(shí)，糖苷與苷元兩者均能更好地溶劑化，若乙醇體積分?jǐn)?shù)過高則不利于黃酮苷類成分的溶解。此外，從實(shí)際生產(chǎn)成本方面考慮，需節(jié)約乙醇的用量，故乙醇體積分?jǐn)?shù)應(yīng)在40%～60%范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響

料液比篩選：分別按料液比 1∶5、1∶10、1∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30(g∶L)的比例加入溶劑進(jìn)行提取，平行提取3次，按2.2項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮含量并計(jì)算其提取率，結(jié)果見圖5。可見，溶劑比例逐漸增大，總黃酮的提取率逐漸升高，但當(dāng)料液比超過1∶15(g∶L)后，再增加溶劑的用量時(shí)總黃酮提取率并無明顯提高，反而延長了溶劑回收、產(chǎn)物濃縮干燥等后續(xù)步驟的耗時(shí)，故對(duì)料液比應(yīng)在 1∶10～1∶20(g∶L)范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化。

圖5 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

2.5 正交試驗(yàn)

直觀分析和極差分析：根據(jù)單因素試驗(yàn)，對(duì)提取總黃酮所需的SDS體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲功率（B）、提取時(shí)間（C）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）、料液比（E）5 個(gè)因素進(jìn)行 3 水平的正交試驗(yàn) L27（35）分析。結(jié)果見表2和表3。得出的最佳提取條件為 A2B2C1D3E1，即 SDS終體積分?jǐn)?shù)為1.5%，超聲功率為 600 W，提取15 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比為1∶15(g∶L)。極差分析結(jié)果顯示，各因素對(duì)總黃酮提取率的影響強(qiáng)度依次為A＞B＞D＞E＞C。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

表3 L27(35)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

方差分析：為了區(qū)分因素水平和試驗(yàn)誤差引起的數(shù)據(jù)波動(dòng)，需在直觀分析和極差分析基礎(chǔ)上進(jìn)行方差分析[9]。計(jì)算各因素的平均方差，其中因素C平均方差值最小，故將因素C選為誤差項(xiàng)。方差分析結(jié)果表明，A，B，D 3個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率的影響差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而C和E兩因素對(duì)總黃酮提取率的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表4。

表4 方差分析結(jié)果

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取 5份藥材樣品，每份各 5.00 g，按 2.5項(xiàng)下最佳提取條件進(jìn)行操作，按2.2項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮含量并計(jì)算其提取率。結(jié)果提取率分別為4.03%，4.02%，4.05% ，4.03% ，4.06% ，平均 4.04% ，RSD 為 0.81%(n＝5)，表明優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定可靠，提取率較高。

3 討論

L27（35）正交試驗(yàn)分析結(jié)果表明，表面活性劑體積分?jǐn)?shù)、超聲功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)為顯著影響總黃酮提取率的主要因素。在表面活性劑的選擇上，本試驗(yàn)中分別考察了離子型和非離子型2種HLB值大于13.0的表面活性劑對(duì)總黃酮提取率的影響。可見，使用離子型表面活性劑的提取率明顯高于非離子型表面活性劑。黃酮類化合物結(jié)構(gòu)上含有多個(gè)酚羥基而帶有酸性，在一定pH范圍內(nèi)帶電，因此可通過靜電力與帶有電荷的離子型表面活性相互親合，從而加強(qiáng)SDS等表面活性劑的增溶作用，提高總黃酮提取率[10]。表面活性劑可通過形成膠束結(jié)構(gòu)來增加溶質(zhì)的水溶性，臨界膠束濃度（CMC）是衡量表面活性劑增溶能力的關(guān)鍵指標(biāo)，溶劑中CMC值越小，增溶能力越強(qiáng)。由表面活性劑的篩選結(jié)果可推測(cè)，在60% 乙醇中，SDS的CMC值最小。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)SDS體積分?jǐn)?shù)達(dá)2.0%后，即使繼續(xù)增加，總黃酮的提取率也不再增加，這是由于SDS體積分?jǐn)?shù)超過CMC后，繼續(xù)增加SDS的劑量，形成膠束數(shù)量并未隨之增加，故未能提高總黃酮提取率。此外，過多使用SDS，可導(dǎo)致藥材中其他成分的溶解度增加，從而引入其他雜質(zhì)。

超聲提取法是目前廣泛用于中藥成分提取的方法之一，利用超聲波的高頻機(jī)械振蕩作用使溶劑快速進(jìn)入植物細(xì)胞中，同時(shí)通過空化效應(yīng)瞬間將植物組織和細(xì)胞分解、破裂，使細(xì)胞的內(nèi)容物釋放與溶出，且超聲波具有熱效應(yīng)，可增大細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的溶解度或擴(kuò)散速率，3種作用機(jī)制相互配合發(fā)揮作用，可大大提高中藥成分的提取率[11]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲功率是影響黃酮提取率的次要因素，超聲功率的設(shè)定必須適中，功率偏低，提取率不高，而功率過高，產(chǎn)生的熱效應(yīng)過大，會(huì)導(dǎo)致穩(wěn)定性較差的黃酮類成分氧化或分解[12]，正交試驗(yàn)分析顯示功率設(shè)為600 W為最佳。

黃酮類化合物的提取主要以乙醇為溶劑，90%～95%乙醇適用于苷元的提取，60%乙醇適用于黃酮苷的提取，將優(yōu)化工藝的驗(yàn)證結(jié)果和乙醇體積分?jǐn)?shù)單因素提取結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，可見在同樣以60%乙醇作為提取溶劑的條件下，前者的提取率明顯高于后者，原因是適量的SDS作為增溶劑能有效增加黃酮苷元在60%乙醇中的溶解度，從而顯著提高總黃酮提取率，同時(shí)也可減少乙醇的用量，降低生產(chǎn)成本。

超聲提取時(shí)間和料液比在5個(gè)因素中對(duì)總黃酮提取率的影響較小，但兩提取因素的設(shè)定仍值得注意，提取時(shí)間過長，超聲熱效應(yīng)可產(chǎn)生過多的熱量，會(huì)導(dǎo)致黃酮分子中具有還原性的酚羥基發(fā)生氧化[13]；溶劑用量過多，會(huì)增加溶劑回收、提取物濃縮、產(chǎn)物干燥等后續(xù)步驟的時(shí)間消耗，導(dǎo)致生產(chǎn)效率降低，成本耗費(fèi)增加。綜合本試驗(yàn)各方面數(shù)據(jù)分析，利用表面活性劑-超聲協(xié)同提取紅景天總黃酮，按料液比1∶15(g∶L)加入60%乙醇作為溶劑，以終體積分?jǐn)?shù)1.5%的SDS為增溶劑，超聲（功率設(shè)為600 W）提取15 min，可獲得滿意的總黃酮提取率。