十味木香散質量標準研究

高永民，秦啟亮，胡耀嘉

（1.青海省西寧市第一人民醫院藥品調配站，青海 西寧 810000； 2.青海省黃南藏族自治州食品藥品檢驗檢測中心，青海 黃南 811399； 3.蘭州大學第一臨床醫學院，甘肅 蘭州 730000）

十味木香散為藏族經驗方，收載于六省區《藏藥標準》，由木香、余甘子、蓽茇、豆蔻、馬尿泡、塞北紫堇、酸藤果、石榴子、人工牛黃、訶子10味藥材組方[1]，有驅蟲、止痛功效，是藏醫用于治療“年”及蟲引起的急性腹痛常用藥，使用歷史悠久，療效確切。目前的質量標準中僅有性狀和制劑通則中規定的檢查項，無制劑質量標準項。為了更全面控制其的內在質量，故本試驗中采用薄層色譜（TLC）法對木香、馬尿泡和人工牛黃等藥味進行鑒別，同時采用高效液相色譜（HPLC）法測定該制劑中木香的有效成分木香烴內酯及去氫木香內酯含量?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290 Infinity型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Inertsil C18色譜柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；BSA323S型電子天平（德國賽多利斯儀器有限公司）；KQ-600型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9070型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；TGL16MB型高速離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）；ZF-6型三用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 試藥

木香對照藥材（批號為 120921-201309）、去氫木香內酯（批號為111525-201209）、硫酸阿托品（批號為100040-201011）、氫溴酸東莨菪堿（批號為 100049-200308）、膽酸（批號為 110775-201105）、豬去氧膽酸（批號為110749-201316），均購自中國食品藥品檢定研究院；收集的5批次十味木香散樣品均為黃南藏族自治州藏醫院制劑室提供（批號分別為20140301，20140501，20140901，20150301，20150401）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別

木香[2-3]：取樣品粉末 2 g，加乙醚 30 mL，超聲(功率200 W，頻率 40 kHz，下同)處理15 min，濾過，濾液揮干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液；另取木香對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液；再取去氫木香內酯對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液；按處方比例去除木香藥材，并按供試品溶液方法制備陰性對照品溶液。照TLC法（2015年版《中國藥典（四部）》通則 0502，以下簡稱“通則 0502”）試驗，吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以環己烷-丙酮（10∶3，V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液及對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1。

馬尿泡[4]：取樣品粉末10 g，加氨水5 mL潤濕，用氯仿50 mL超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液；取硫酸阿托品對照品、氫溴酸東莨菪堿對照品，分別加甲醇，制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液；按處方比例去除馬尿泡，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照TLC法(通則0502)試驗，吸取4種溶液各 5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-濃氨水（15∶6∶1，V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以改良碘化鉍鉀試液。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色斑點，陰性對照無干擾。詳見圖 2。

圖1 木香薄層色譜圖

圖2 馬尿泡薄層色譜圖

圖3 人工牛黃薄層色譜圖

人工牛黃[5-6]：取樣品粉末1 g，加乙醇10 mL，振搖15 min，離心，取上清液，作為供試品溶液；另取膽酸、豬去氧膽酸對照品，加乙醇，制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作為對照品溶液；按處方比例去除人工牛黃，并按供試品溶液方法制備陰性對照品溶液。照TLC法（通則0502）試驗，吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-正己烷-醋酸-甲醇（16 ∶4∶0.5∶1，V／V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%磷鉬酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色熒光斑點，陰性對照無干擾。詳見圖3。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件及系統適用性試驗[7-9]

色譜柱：Inertsil C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -水（58 ∶42，V／V）；檢測波長：225 nm；柱溫：30℃。理論板數按木香烴內酯峰、去氫木香烴內酯峰計均應不低于3 000，分離度大于1.5，拖尾因子大于0.99。對照品溶液出峰位置上無干擾峰出現，表明陰性對照無干擾。色譜圖見圖4。

2.2.2 溶液制備

稱取木香烴內酯對照品8.14 mg、去氫木香內酯對照品 10.87 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得木香烴內酯、去氫木香內酯質量濃度分別為 0.325 6 g／L 和 0.434 8 mg／mL 的混合對照品貯備液；精密量取上述混合對照品溶液5 mL，置25 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得木香烴內酯、去氫木香內酯質量濃度分別為 0.065 1 g／L和0.087 0 g／L的混合對照品溶液。取樣品粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲提取30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按照處方組成及比例，取除木香外的其余藥味，按制備工藝要求制成不含木香的制劑，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

線性關系考察：精密吸取2.2.2項下混合對照品溶液 1，2，4，8，16，20 μL，按 2.2.1 項下色譜條件測定，以峰面積（Y）為縱坐標、進樣量（X，μg）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程，木香烴內酯為 Y1＝1 266.22 X1-3.829，r＝0.999 6（n＝6）；去氫木香烴內酯為 Y2＝1 321.22 X2-6.711，r＝ 0.999 4（n ＝6）。結果表明，木香烴內酯、去氫木香烴內酯進樣量分別在0.065 1～1.030 2 μg和 0.087 0 ～ 1.740 0 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取上述混合對照品溶液5 μL，重復進樣6次，按2.2.1項下色譜條件進樣，測定峰面積。結果木香烴內酯、去氫木香內酯峰面積的 RSD分別為0.86%和 0.83%（n＝6），表明儀器精密度良好。

圖4 十味木香散高效液相色譜圖

穩定性試驗：取批號為20140501的樣品，制備供試品溶液，分別于 0，2，4，8，10，12 h 時進樣 5 μL，測定峰面積。結果木香烴內酯、去氫木香內酯峰面積的 RSD分別為 1.04%和 0.99%（n＝6），表明供試品溶液在 12 h內基本穩定。

重復性試驗：取同一批（批號為20140501）樣品1 g，依法制備供試品溶液 6份，分別進樣 5 μL，按 2.2.1項下色譜條件進樣測定。結果木香烴內酯、去氫木香內酯峰面積的 RSD 分別為 0.91% 和 0.73% （n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為20140501，木香烴內酯含量為 2.093 mg／g，去氫木香內酯含量為 2.568 mg ／g）6 份，每份 0.5 g，精密稱定，分別精密加入木香烴內酯、去氫木香內酯質量濃度分別為0.325 6 mg／mL 和 0.434 8 mg／mL 的混合對照品溶液各3 mL，依法制備供試品溶液，進樣測定，計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n＝6）

2.2.4 樣品含量測定

取5批十味木香散，依法制備供試品溶液，分別進樣記錄峰面積值，并計算木香烴內酯和去氫木香內酯含量。以5批樣品平均含量下浮20%作為本品的含量限度標準，故暫定本品每克含木香以木香烴內酯、去氫木香烴內酯的總量計不得少于3.59 mg／g。結果見表2。

表2 5批樣品含量測定結果

3 討論

本試驗中通過對不同極性提取溶劑、提取方法及提取時間進行考察，建立了方中木香、馬尿泡、人工牛黃的TLC鑒別方法；曾對方中的其他藥味開展研究，但由于其陰性對照干擾較大或對照藥材、對照品不易得到等原因，試驗未成功。木香中木香烴內酯、去氫木香烴內酯的含量測定試驗過程中，分別考察了以乙酸乙酯、氯仿、甲醇為提取溶劑的情況，結果顯示，以甲醇為溶劑時的提取率高于乙酸乙酯、氯仿，因此選用甲醇為供試品提取溶劑；還考察以乙腈-水、甲醇-水為流動相時的分離情況，結果用甲醇-水溶液為流動相時基線較平穩，對被測組分峰無干擾，因此選擇甲醇-水作為流動相。

方法學驗證結果表明，本研究中建立了鑒別木香、馬尿泡、人工牛黃的TLC法，分離效果好，陰性無干擾，同時建立了測定木香中木香烴內酯及去氫木香內酯含量的HPLC法，方法可行，操作簡單，重復性良好，分離度好，陰性無干擾，故本研究中建立的方法可用于十味木香散的質量控制。