基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對鎮(zhèn)喘保肺湯治療腎氣虛證支氣管哮喘人體尿液代謝組學(xué)分析*

余鵬飛 宋 紅

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

支氣管哮喘（以下簡稱哮喘）已經(jīng)成為當(dāng)今世界上最為普遍的疾病之一，是由多種細(xì)胞(嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等)和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病[1]。中醫(yī)學(xué)根據(jù)辨證論治將哮喘分成熱哮、冷哮、虛哮3個(gè)證型。從證候角度，每一個(gè)中醫(yī)證候是由許多因素組成的復(fù)雜性表型，使用單一的生理、生化指標(biāo)來表達(dá)描述證候本質(zhì)，闡釋生理病理機(jī)制及疾病治療前后的變化存在局限性和片面性。近幾年迅速發(fā)展的系統(tǒng)生物學(xué)，以“解析生命過程的復(fù)雜性，利用整體性、系統(tǒng)性研究手段發(fā)現(xiàn)揭示生命活動(dòng)本質(zhì)規(guī)律”為目標(biāo)[2]，其中的代謝組學(xué)通過生化表達(dá)的終端性信息，最具備反映和解決證候問題的“組”“群”“譜”集成分析功能。

在哮喘的治療上，鎮(zhèn)喘保肺湯為本課題基于辨證論治用于治療腎氣虛證哮喘的經(jīng)驗(yàn)用方，以此方為媒介，利用代謝組學(xué)方法研究中藥治療哮喘的多靶點(diǎn)作用機(jī)制，從而揭示系統(tǒng)內(nèi)部各組成成分及它們的相互作用和運(yùn)行規(guī)律。在本次臨床試驗(yàn)中，12例哮喘患者服藥前后和8名健康對照的尿液樣本通過液質(zhì)聯(lián)用分析，以評估與哮喘有關(guān)的終端信息，從而可能揭示哮喘的病理機(jī)制和腎氣虛證哮喘的證本質(zhì)。

1 臨床資料

中醫(yī)診斷參照《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》中有關(guān)“虛哮”進(jìn)行診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①發(fā)作時(shí)喉中哮鳴有聲，呼吸困難，甚則張口抬肩，不能平臥，或者口唇指甲紫鉗；②呈反復(fù)發(fā)作性，常因氣候突變、飲食不當(dāng)、情志失調(diào)、勞累等因素誘發(fā)，發(fā)作前多有鼻癢、噴嚏、咳嗽、胸悶等先兆；③有過敏史或家族史；④兩肺可聞及哮鳴音，或伴有濕羅音；⑤血嗜酸性粒細(xì)胞可增高；⑥痰液涂片檢查可見嗜酸細(xì)胞；⑦胸部X線檢查一般無特殊改變，久病可見肺氣腫征象；⑧年齡范圍在40～80歲之間，男女性別不限。

2 研究方法

2.1 試驗(yàn)分組：對照組（A組）8例，腎氣虛證哮喘組治療前(B組）12例、腎氣虛證哮喘治療后(C組)12例。

2.2 治療方法：對照組不予以任何干預(yù)，納入標(biāo)準(zhǔn)的病人予以鎮(zhèn)喘保肺湯中藥湯劑口服治療，其組成為：人參、附子、五加皮各15g，三七12g，何首烏10g，沉香（研末）、冬蟲夏草各1g，蛤蚧（研末）1.5g。煎服，每日1劑，分早、晚2次服。共治療1月。

2.3 療效評定：治愈：哮喘控制，哮鳴音消失；好轉(zhuǎn)：哮喘緩解，或發(fā)作次數(shù)減少；未愈：癥狀無變化。

2.4 樣品的采集和處理：實(shí)驗(yàn)前2h取出患者尿液樣品，室溫下解凍搖勻，取1.0ml尿液樣品于離心管中，12000r/min離心10min；取上清液200μl于2ml離心管中，加入150個(gè)單位的尿素酶，振蕩30s，在37℃，反應(yīng)1.5h去除尿素；加入1.7ml甲醇、0.2mg/ml的十七酸60μl和0.2mg/ml的2-氯苯丙氨酸60μl，振蕩5min；10000r/min離心10min；取1.5ml上清液于玻璃管中，

50℃真空離心濃縮至干。加入60μl的甲氧胺，封蓋，振蕩30s，在37℃條件下反應(yīng)2h啟蓋；加入60μl三氟乙酰胺(BSTFA)+1%三甲基氯硅烷(TMCS)，封蓋，振蕩30s；在37℃條件下反應(yīng)90min，振蕩30s,即可。

2.5 數(shù)據(jù)處理：液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測后，得到經(jīng)質(zhì)譜分析儀器自帶軟件導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)（質(zhì)荷比對應(yīng)的峰強(qiáng)度）Excel文件，對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，使用SMICA-P軟件進(jìn)行分析，對該數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)建模分析。根據(jù)OPLS-DA模型的 VIP（Variable Importance in the Projection）值，并結(jié)合t-test的P值來尋找差異性表達(dá)代謝物。差異性代謝物的定性方法為：搜索在線數(shù)據(jù)庫（Metlin）（比較質(zhì)譜的質(zhì)荷比m/z或者精確分子質(zhì)量Mass）并通過檢索在線數(shù)據(jù)庫（KEGG、HMDB、LIPID、Metlin）定性可能的差異性代謝物。然后，對差異性代謝物進(jìn)行代謝通路分析。

3 結(jié)果

3.1 PCA分析：試驗(yàn)結(jié)束后統(tǒng)計(jì)，C組最后采集的樣本量為8例；A組為8例，B組為12例。從圖1中可以看出，A組與B組相比較，B組的代謝組已經(jīng)偏離了正常狀態(tài)，兩組間具有顯著差異；B組與C組相比較，也具有差異。

圖1 A組與B組、B組與C組的PCA得分圖（ESI+）

圖2 A組與B組、B組與C組的OPLS-DA得分圖（ESI+）

表1 正模式下B-C兩組的差異性代謝物

3.2 OPLS-DA分析：在尋找代謝差異物的過程中，為了將樣本與研究目的不相關(guān)的非誘導(dǎo)性生物學(xué)差異及樣本處理及分析過程中的技術(shù)性偏差的變異區(qū)別開來，我們進(jìn)一步應(yīng)用OPLS-DA分析，A組和B組在正模式下得到1個(gè)主成分和3個(gè)正交成分，R2X=0.528，R2Y=0.998，Q2=0.83；B組和C組在正模式下得到1個(gè)主成分 和 5個(gè) 正 交成分 ，R2X=0.808，R2Y=0.999，Q2=0.989。模型的參數(shù)R2Y表示模型的解釋率，Q2表示模型的預(yù)測率。其得分圖如圖2所示：其中用于判別模型質(zhì)量好壞的R2Y和Q2值均大于0.4，表示模型可靠。從圖中也可看出，在第一預(yù)測的主成分（t[1]）方向上具有很好的區(qū)分聚類趨勢，該模型只有一個(gè)預(yù)測主成分能夠代表腎氣虛證哮喘所造成的人體尿液代謝組的改變。

3.3 組間差異性代謝產(chǎn)物的挖掘及鑒定：采用OPLS-DA模型的VIP值（閾值＞1），并結(jié)合t-test的P值（P＜0.05）來尋找差異性代謝物。差異性代謝物的定性方法為：搜索在線數(shù)據(jù)庫（Metlin）（比較質(zhì)譜的質(zhì)荷比m/z或者精確分子質(zhì)量Mass）。數(shù)據(jù)見表1、表2。

表2 正模式下A-B兩組的差異性代謝物

數(shù)據(jù)顯示，與正常組相比，哮喘患者的尿液中L-纈 氨酸、L-酪氨酸、吲哚乳酸、膽堿、3-吲哚乙酸、己酸、四氫可的松、十六烷二酸、4-吡哆酸、醋酸等物質(zhì)明顯增加，溶血磷脂酰乙醇胺、L-脯氨酸、孕烯醇酮、雄酮、辛酸、煙酰甘氨酸、二十碳五烯酸、雄甾酮葡萄糖醛酸苷、氫化肉桂酸、睪酮葡萄糖醛酸苷、癸二酸、煙酸等物質(zhì)明顯減少。服用鎮(zhèn)喘保肺湯后，哮喘患者與用藥前相比尿液中N-異戊酰甘氨酸、麥芽糖、甲基丙二酸、腺苷、前列腺素E2、異丁酸等物質(zhì)明顯增加；1-甲基組氨酸、水楊酸、3-甲基硫代丙酸、牛磺酸、L-酪氨酸、4-吡哆酸、2-羥基己二酸、肌酸、N1-乙酰亞精胺、1-甲基腺苷、N6，N6，N6-三甲基-L-賴氨酸明顯減少。L-酪氨酸和4-吡哆酸在哮喘患者身上高于正常組，服藥后降低。

我們將上述差異代謝物的名稱進(jìn)行通路歸屬，并在線分析（MetaboAnalyst），并結(jié)合P＜0.05，F(xiàn)DR≠1，A組與B組的數(shù)據(jù)在類固醇激素生物合成（Steroid hormone biosynthesis）的通路上匹配到4/99。由于在線數(shù)據(jù)庫的局限性，B組與C組的數(shù)據(jù)沒有符合要求，但其差異代謝物的通路可能主要涉及氨基酸代謝、維生素B6的代謝、氮代謝、牛磺酸和亞牛磺酸代謝、硫胺素代謝等。

4 討論

酪氨酸是一種非必需氨基酸，是機(jī)體多種生成物的原料，酪氨酸在體內(nèi)可通過不同代謝途徑轉(zhuǎn)化為多種生理物質(zhì)，如多巴胺、腎上腺素、甲狀腺素、黑色素及罌粟(鴉片)的罌粟堿。這些物質(zhì)與神經(jīng)傳導(dǎo)和代謝調(diào)節(jié)控制關(guān)系密切。而酪氨酸激酶抑制劑可能影響氣道炎癥和重塑，作為治療哮喘的新藥也正在動(dòng)物模型和早期臨床試驗(yàn)中進(jìn)行測試[4]。這提示酪氨酸或其合成的上游物質(zhì)減少，可能與治療哮喘的作用機(jī)制有關(guān)。另外，F(xiàn)ogarty A[5]等在臨床病例對照中發(fā)現(xiàn)而精氨酸、苯丙氨酸和色氨酸可能對哮喘有不良影響。而在苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成通路中（圖3），苯丙氨酸在苯丙氨酸羥化酶的作用下轉(zhuǎn)變成酪氨酸，從而酪氨酸增加，這與我們在哮喘患者中檢測到的酪氨酸增加，服藥后降低的變化結(jié)果吻合。因而鎮(zhèn)喘保肺湯很可能是通過抑制酪氨酸的合成從而控制哮喘的發(fā)作。

圖3 苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成通路（部分）

在肝臟中，吡哆醛在醛氧化酶作用下不可逆地轉(zhuǎn)化為4-吡哆酸，4-吡哆酸也是維生素B6的最終排泄產(chǎn)物[6-7]。最新研究結(jié)果表明，循環(huán)的吡哆醛-5'-磷酸（PLP）與肺癌風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。PAr指數(shù)定義為4-吡哆酸/（吡哆醛+PLP）的比率，反映了炎癥期間維生素B6分解代謝增加。PAr已被定義為前瞻性隊(duì)列研究中肺癌風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志[8]。患者服用鎮(zhèn)喘保肺湯之后4-吡哆酸的降低提示該方使炎癥得到了控制，維生素B6的分解代謝降低。但是這一結(jié)論只是側(cè)面應(yīng)證了鎮(zhèn)喘保肺湯控制肺部炎癥的療效指標(biāo)，提示了該方對肝臟代謝的影響顯著，仍然不足以闡明鎮(zhèn)喘保肺湯的作用機(jī)制。

通過上述研究結(jié)果的分析，筆者認(rèn)為，在下一步對鎮(zhèn)喘保肺湯作用機(jī)制的研究工作中，重視其在肝臟代謝中的相關(guān)作用機(jī)制，有可能是我們闡明作用機(jī)制的關(guān)鍵所在。

5 參考文獻(xiàn)

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