胰腺癌循環腫瘤細胞檢測及其臨床應用

余 倩 姜立新

胰腺癌的轉移和復發是影響腫瘤患者長期存活的最主要因素，在轉移的過程中，原發腫瘤細胞可通過多種途徑侵入到血液循環系統中，產生循環腫瘤細胞 (CTCs)。這些細胞以單個或聚集成團的形式存在，部分CTCs作為腫瘤轉移的種子，在脫離原發病灶后能夠抑制失巢凋亡，在血液循環中抵抗流體剪切力和躲避免疫監視，具有在機體其他部位附著形成新的癌轉移灶的潛能[1]。CTCs有原發灶細胞的生物學特性，因此被認為在反映癌癥惡性程度及預后方面有重要的應用潛能。研究表明，CTCs的檢測結果、細胞計數、特定表面標志物識別與胰腺癌患者的診斷及分期、療效判斷和預后顯著相關，能夠為胰腺癌的個體化診療提供可靠依據[2]。

一、胰腺癌CTCs體外檢測

胰腺癌CTCs進入血液循環后，絕大部分會受到失巢凋亡，流體剪切力和機體免疫識別殺傷作用的影響，最終在外周血中存活的CTCs數量稀少(約每109～1010個血細胞中有1～10個CTCs)。體外檢測又被稱為“液體活檢”，主要通過采集血樣，對CTCs進行計數及亞群特征分析。主要的分離檢測方法可分為免疫介導法和分子法(主要為PCR介導的檢測)兩大類[3]。此外，利用密度梯度離心和基于細胞尺寸的物理法分離，可對血樣中微量的CTCs進行富集，從而提高檢測敏感度[4]。

1.免疫介導法檢測胰腺癌CTCs：基于抗原-抗體結合反應的免疫學方法以其特異性、有效性，在胰腺癌CTCs檢測中發揮了重要作用。胰腺癌為上皮組織來源腫瘤，在其細胞表面表達特殊的表面分子，而血液中的紅細胞和白細胞則幾乎不表達上皮來源的表面分子。最常見的選擇性標志物為上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)。

CellSearch系統是唯一受美國食品藥品監督管理局(FDA)批準的，用于患者體內CTCs分離檢測的技術，該技術是一種自動化的CTCs免疫富集和染色的系統。檢測過程中，偶聯有EpCAM抗體的磁珠捕獲CTCs，通過磁珠分選將其富集[5]。然后固定富集的細胞并用DAPI、CK和CD45染色，通過CellSpotter分析儀(Veridex)將CK+、DAPI+、CD45-細胞計數為CTCs。

Hugenschmidt等[6]通過CellSearch系統檢測可切除的胰腺癌和壺腹周圍癌患者外周血CTCs與疾病預后，結合患者術后病理分析，高風險患者CTCs陽性(≥1/7.5ml)占6.8%(10/147)，晚期患者CTCs陽性占6.2% (2/33)，低風險和良性腫瘤患者CTCs均為陰性，盡管成功切除腫瘤，但術前CTCs陽性的患者仍顯示出不良預后。Okubo等[7]通過CellSearch系統檢測不可切除的胰腺癌患者外周血CTCs與疾病預后，CTCs陽性患者(21/65)總生存率明顯低于陰性患者，且伴有肝轉移的胰腺癌患者CTCs數量明顯增多，研究表明CTCs可預測晚期胰腺癌患者化療預后和治療反應。

微流體芯片技術(CTC-Chip)是基于EpCAM陽性選擇的另一種檢測方式，Nagrath等[8]于2007年首次報道，CTC-Chip由一系列具有EpCAM抗體的微柱組成，當外周血樣本流過芯片時，因抗原-抗體反應，腫瘤細胞被芯片捕獲。Ko等[9]研制的CTCs熒光原位雜交芯片可實現分離并檢測全血中的CTCs，該芯片將胰腺癌CTCs定義為RNA FISH(CK18+、CK19+、Ctnnd1+、CD45-)，并應用于胰腺癌小鼠模型及25例晚期胰腺癌患者血液標本中。

以上兩種基于EpCAM陽性選擇的胰腺癌CTCs檢測方式也存在一定的局限性，由于腫瘤細胞的異質性及上皮-間質轉化(EMT)等特性，并非所有腫瘤細胞都表達EpCAM抗原，這有可能會降低CTCs檢測率。

免疫磁珠陰性富集可對胰腺癌CTCs進行陰性選擇，將患者血樣中的紅細胞裂解后，通過使用表面帶有白細胞特異性抗體(如CD45)的磁珠消耗胰腺癌患者血樣中的白細胞，獲得未標記的胰腺癌CTCs懸液。Zhang等[10]用抗CD45抗體消耗3.75ml血樣中的CD45+細胞，并通過結合CK、CD45、DAPI和CEP8鑒定胰腺癌患者CTCs。該方法不受腫瘤細胞異質性及EMT特性影響，能夠提高CTCs檢測率[11]。

2.基于分子法PCR的胰腺癌CTCs檢測：該方法將胰腺癌患者血樣中腫瘤特異性mRNA高水平表達作為CTCs的替代標志物，通過將正常血樣作為對照設定閾值，以便定量檢測腫瘤特異性mRNA[12，13]。

Chausovsky等首次使用巢式實時定量PCR(nested RT-PCR)檢測胰腺癌患者血樣中CK20 mRNA的表達，79%(22/28)胰腺癌患者CK20擴增，22例正常對照者CK20擴增均為陰性。Zhou等[14]研究表明，多標記比單標記顯示出更好的結果，對25例初診胰腺癌患者進行人端粒酶反轉錄酶(hTERT)、C-MET、CK20和CEA的RT-PCR，檢測陽性表達率分別為100%(25/25)、80%(20/25)、84%(21/25)和80%(20/25)。

基于PCR的胰腺癌CTCs檢測具有較高的敏感度，但是由于并缺乏胰腺癌特異性mRNA，常用上皮特異性mRNA替代，因此敏感度往往會伴隨著假陽性的出現。

二、胰腺癌CTCs體內檢測

Lin的研究小組開發了一種用于CTCs檢測的體內技術，稱為活體流式細胞術(IVFC)，它結合了傳統流式細胞術和共聚焦顯微鏡檢測。活體檢測的方法包括活體熒光流式細胞術(FFC)和活體光聲流式細胞術(PAFC)：FFC的原理為當帶有熒光標記的CTCs流經激光時，被激發的熒光被光電倍增管收集，產生不同于血液背景的信號，從而實現CTCs的活體檢測[15]。PAFC利用生物組織的光聲效應，當激光照射組織時，組織吸收光能量產生熱膨脹，向外輻射超聲波，通過分析超聲換能器接收的不同聲波信號來檢測CTCs[16]。

IVFC可用于研究活體循環系統中胰腺癌CTCs在特定時間區間內的數量變化趨勢，為療效判斷和預后提供依據。目前實驗研究多采用胰腺癌細胞體外標記，注射入實驗動物循環系統，或異種移植到實驗動物體內，對胰腺癌CTCs變化趨勢進行連續監測。研究表明，CTC簇比單個CTC有更大的轉移潛能，IVFC檢測CTC簇的熒光信號顯示為多個峰，而單個CTC的熒光信號顯示為單峰，CTC簇的信號比單個CTC具有更長的持續時間[17]。IVFC可以實時、定量地對胰腺癌CTCs進行活體檢測，相較于體外檢測方式，具有非侵入性、高敏感度和動態監測的優勢，可用于研究胰腺癌發展、轉移的CTCs動力學變化。

三、CTCs在胰腺癌診療中的應用

1.診斷和分期：Xu等[11]通過陰性富集，免疫熒光8號染色體原位雜交(NE-iFISH)來捕獲和鑒定胰腺癌患者的CTCs，NE-iFISH系統在胰腺癌患者中表現出極高的CTCs檢出率(90%)，結合CTCs≥2和CA19-9>37μmol/L，PC的診斷率可達到97.5%。

Ankeny檢測了72例胰腺癌患者和28例其他胰腺疾病患者的CTCs，顯示Ⅰ～Ⅱ期患者CTCs陽性率為54.84%(17/31)、Ⅲ期陽性率為78.57%(11/14)、Ⅳ期陽性率為96.30%(26/27)；28例其他胰腺疾病患者中僅1例檢測出1個CTCs。統計表明可以將CTCs≥3個/4毫升作為Ⅳ期胰腺癌的評判標準，CTCs有望成為胰腺癌診斷和分期的生物學標志物。

2.療效和預后:Torphy等[18]建立胰腺導管腺癌小鼠模型，隨機分為兩組，分別使用化療藥物和空白載體治療28天，并于治療前后檢測CTCs，化療組CTCs計數治療后明顯減少(26.61個/250微升 vs 2.21個/250微升,P=0.021)，而空白組治療前后CTCs計數比較差異無統計學意義(23.26個/250微升 vs 11.89個/250微升,P=0.808)。CTCs的連續監測可以用作預測治療反應的微創方法以指導治療方案。

楊陽[19]通過檢測48例胰腺癌患者術后外周血CTCs變化情況，探討高強度聚焦超聲消融(high-intensity focused ultrasound, HIFU)與開放手術兩種治療方法對胰腺癌細胞血行性播散的影響, 應用免疫磁珠負性富集結合免疫熒光原位雜交技術檢測外周血CTCs。研究發現，開放手術和HIFU治療均有可能發生醫源性癌細胞血行播散，并且手術治療CTCs檢出率高于HIFU治療，因此胰腺癌患者接受開放手術或HIFU治療后，應酌情給予化療、增強免疫力等輔助治療。

四、展 望

CTCs診斷胰腺癌的敏感度低于EUS-FNA，但特異性(100%)與組織病理活檢相當，具有低風險、低成本、高特異性等優點[20]。目前對胰腺癌CTCs的檢測尚未形成統一指南，檢測方法的差異使得研究之間的比較變得困難，并且在廣泛采用之前，必須嚴格驗證“可重復性”。未來的發展中，實現胰腺癌CTCs檢測的標準化，需要更多獨立驗證研究以及在大型前瞻性臨床試驗中的嚴格評估。