CD22-CD19-CAR-T細胞治療兒童難治性復發性B淋巴細胞白血病的研究進展

孫柏青 張 瑩 張 靜 張麗坤 曹峰林

B-ALL患兒化療后緩解率達到95%以上，雖然化療是兒童難治性復發性B淋巴細胞白血病首選治療方法，但尚有部分患者對化療無效或化療后復發，所以難治性和復發性患者的治療效果仍然是個挑戰[1]。迫切需要用于改善難治性復發性結果的新型方法，嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)被用于患有難治性復發性的兒童急性淋巴細胞白血病患者，其中CD19靶向的嵌合抗原受體(CAR)修飾的T(CAR-T)細胞免疫療法已經在兒童難治性復發性白血病中顯示出令人印象深刻的結果，緩解率為70%～90%，但仍會引起一部分患者在CD19-CAR-T細胞治療后復發[2]。同時細胞因子釋放綜合征(cytokine-release-syndrome，CRS)和神經毒性在一部分患者中可能危及生命。為降低復發率并治療那些CAR-T細胞治療后患有抗原丟失的復發患者，順序輸注CD22-CD19-CAR-T細胞運用于臨床治療，即使產生了適度的CRS,但尚未觀察到神經毒性的證據及復發。白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)受體拮抗劑和類固醇類激素已被用于控制這些毒性，使得CD22-CD19-CAR-T細胞能夠在沒有明顯功效損害的情況下使用。

一、CAR-T細胞結構與特點

1.CAR-T細胞制備及優勢：CAR-T細胞是CAR雜合受體，CAR是一種合成蛋白，經基因工程改造后可在T細胞表面表達。它包含細胞外結合結構域、鉸鏈區、跨膜結構域和一個或多個細胞內信號轉導結構域[3]。由于嵌合性質，使用基因轉移技術(例如慢病毒或反轉錄病毒載體)重新編程患者的T細胞以表達CAR，CAR具有以獨立于主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)的方式將T細胞通過非MHC限制性識別特定抗原能力，從而增強識別與殺傷腫瘤細胞的能力[4]。CAR-T是患者自身的T細胞，其在體外重新設計以表達嵌合抗原受體(CAR)，使其能夠識別在白血病細胞表面上表達的一種抗原。在臨床環境中，CAR-T被激活，進行基因改造，擴增，然后再輸注回到患者身上，以便重建永久性的抗腫瘤免疫系統。作為一種“活的藥物”，不僅不會被代謝掉，還會在患者體內復制、遷移、增殖和殺死表達同源抗原的靶細胞，通過強大的體外擴增能力形成記憶細胞，一次輸注體內存續時間久，針對低表達量的靶分子仍然有效等[5]。

2.CAR-T細胞結構：CAR-T細胞結合了靶標識別中的抗體和效應物的強烈特征，并且T細胞和效應細胞的長期功能直接被帶入腫瘤細胞。CAR-T細胞是由3個結構域組成的人工受體：①來自抗體單鏈可變片段(scFv)的細胞外抗原特異性結合結構域；②通常來源于CD8α的鉸鏈和跨膜區段或IgG結構域；③細胞內T細胞信號轉導結構域。CAR-T細胞經基因工程改造以通過病毒(反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒)或非病毒技術(例如電穿孔、基于轉座子或基因編輯系統)表達CAR。

3.CAR-T細胞結構演變及特點：通過對胞內信號區設計的改造，CAR經歷了從第1代到第4代的變遷。第1代CAR僅含有來自TCR/CD3受體復合物的基于酪氨酸的zeta信號轉導亞基，與該zeta結構域相鄰，但增殖效應小、釋放細胞因子少，導致抗腫瘤細胞效應不足。在第2代和第3代CAR中向細胞內結構域添加共刺激信號，旨在改善工程化T細胞的存活。第2代CAR含有一個額外的共刺激分子，在治療血液腫瘤方面應用廣泛。第3代CAR含有兩個額外的共刺激分子，或誘導型T細胞共刺激分子，使得持續性更強。第4代CAR增加了編碼CAR與其反應性的啟動子載體，可以在激活時表達調節抗腫瘤微環境的細胞因子進而招募并活化更多的免疫細胞攻擊腫瘤細胞, 并通過調節腫瘤微環境從而增強免疫反應。

二、CAR-T毒性不良反應與治療

1.脫靶效應：由于CAR-T細胞所針對的腫瘤細胞相關抗原在正常組織中存在不同程度的表達，所以在對靶細胞有抗原親和力和殺傷力的CAR-T細胞同時也會攻擊正常組織細胞，從而造成正常組織與器官的損傷。通過導入自殺基因、構建抑制性CAR-T細胞及雙靶抗原CAR-T細胞可改善脫靶效應。

2.CRS：通常發生于CAR-T細胞輸注后2～3周內，與CAR-T細胞回輸劑量無關，患者體內常存在高水平的IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-2、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、單核細胞趨化蛋白1(human monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)、可溶性gp120等細胞因子及腫瘤負荷，同時粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)是一種關鍵的CRS促進蛋白，與CRS水平呈正相關[6]。臨床可通過血清GM-CSF、血清C反應蛋白和鐵蛋白水平監測。常見的表現形式包括發熱、寒戰、低血壓、呼吸困難及臟器功能異常，通?？赏ㄟ^解熱、升血壓、吸氧、水化、堿化等對癥處理，因類固醇類激素影響CAR-T細胞增殖，而常常將IL-6受體拮抗劑作為一線治療方案。必要時可通過敲除CAR-T細胞中GM-CSF基因或通過導入自殺基因等途徑清除體內過多的活化CAR-T細胞控制CRS。

3.神經系統損傷：研究表明，血-腦脊液屏障和星形膠質細胞功能障礙的破壞與神經系統損傷的發展有關，常由于預處理方案藥物、CAR-T細胞穿透血-腦脊液屏障、較高的CAR-T細胞峰值等引起，常伴隨早期或者嚴重CRS反應，臨床癥狀表現為意識不清、抽搐、共濟失調等中樞系統癥狀[7，8]。CAR-T細胞輸注前的炎性反應、內皮功能障礙/激活、峰值CAR-T細胞、細胞因子水平、內皮激活的生物學標志及CSF蛋白水平增加了嚴重的神經系統損傷的風險。治療神經系統損傷需針對細胞因子、單核細胞、內皮細胞及血-腦脊液屏障進行干預[6]。雖然IL-6受體拮抗劑和高劑量類固醇類激素通常可有效控制CRS，但IL-6在逆轉神經毒性方面效果較差, 需通過利用類固醇類激素穿透血-腦脊液屏障的作用而應用于治療神經系統損傷[9，10]。達沙替尼通過可逆地抑制CAR-T細胞的細胞毒性、細胞因子分泌和增殖，且通過穿透血-腦脊液屏障作用，可用于減輕神經系統損傷。

4.移植物抗宿主?。撼鼵AR-T細胞來源于患者本人，而其他非來源于患者本人的非同源CAR-T細胞易引移植物抗宿主病，雖然通過敲除技術可降低移植物抗宿主病風險，但同時存在CAR-T細胞活性降低的風險。雖然臍帶血為非同源制備CAR-T細胞來源，但臍帶血中自然殺傷細胞通過直接殺死腫瘤細胞，可減少移植物抗宿主病風險。

5.噬血性淋巴組織細胞增多癥(fulminanthaemophagocytic lympho histiocytosis，HLH):其特征是巨噬細胞和淋巴細胞過度活化，促炎細胞因子產生，淋巴組織細胞組織浸潤，作為CRS嚴重時表現，患者通常有基因易感性，臨床表現為骨髓可見噬血細胞、外周血細胞計數降低、凝血功能障礙及高熱等。應用托珠單抗或類固醇激素可控制良好。如果患者在48h內沒有臨床或血清學改善，應考慮使用依托普利的額外治療。在不久的將來，在HLH中發揮核心作用的特異性細胞因子將會發生重要作用[6]。

6.B細胞缺如：因CD22-CD19-CAR-T細胞靶向于B細胞表面表達的靶點，可引起B細胞發育不良，導致B細胞缺如。由于CAR-T細胞不會像藥物被代謝掉，還會在體內形成記憶細胞，持續長時間存在，所以B細胞缺如的情況就難以改善。因此，B細胞缺如可作為功能性CAR-T細胞持久性的藥效學標志物[11]。

7.低丙種球蛋白血癥：B細胞缺如會造成嚴重的低丙種球蛋白血癥，需要靜脈注射免疫球蛋白。CD22-CD19-CAR-T細胞引起的長期B細胞缺如，需輸注免疫球蛋白糾正，且僅能補充IgG。

8.感染綜合征：CAR-T治療后的大多數感染發生在中性粒細胞減少癥和(或)嚴重CRS之后，對抗菌治療反應差，反映了感染相關細胞因子的擴增和抗細胞因子治療對免疫的影響及更高程度的免疫功能障礙。也可能與先前的自體或同種異體造血細胞移植、預處理方案有關，其機制與持續的細胞免疫缺陷有關。先前存在的血細胞減少和低丙種球蛋白血癥及CRS可能導致感染異常嚴重。80%的首次感染是在CAR-T輸注后的前10天內，42%在輸注后的前30天內發生細菌、真菌或病毒感染。超過30天，病毒感染占主導地位，晚期感染可能反映長期免疫球蛋白缺乏以及淋巴細胞減少癥。預防感染綜合征應在調節和輸注CAR-T產品之前控制活動性感染，特別是在CRS引起的炎性過程惡化的情況下[12]。

9.惡性腫瘤：反轉錄病毒和慢病毒基因轉移系統是CAR-T細胞療法的遺傳修飾中最常用的載體。衍生自這些病毒家族的載體具有兩種潛在風險：產生復制型病毒和插入誘變，特別是致癌活化。使用γ-反轉錄病毒和慢病毒修飾CAR-T細胞進行的許多臨床試驗尚未證實CAR-T細胞中的插入突變[13]。雖然風險似乎非常低，但是繼發性惡性腫瘤的臨床監測和CAR-T治療后的長期隨訪應繼續成為臨床試驗方案的一部分，需進行前瞻性、多中心、觀察性研究，以評估長期安全性以及治療后發生繼發性惡性腫瘤的風險[14]。

三、CD22-CD19-CAR-T細胞特點

1.CD19-CAR-T細胞治療后復發特點及對策：(1)CD19特異性表達于正常B細胞、 B細胞前體細胞，不表達于造血干細胞及非造血細胞，作為一個理想的治療靶點，CD19-CAR-T細胞的治療使得ALL患者獲得了較好的完全緩解率(complete response,CR)，但復發仍然存在，其中CD19陰性復發最常見[15]。CD19抗原的表達缺失導致的CD19免疫逃逸是CD19-CAR治療B-ALL后最常見的復發原因，其主要機制是:①CD19基因突變或缺失導致合成障礙；②參與CD19合成的相關轉錄因子缺陷；③白血病細胞發生類型的轉變,CD19-陰性白血病亞群引起明顯的骨髓復發；④治療之前存在不同水平的CD19陰性白血病克隆，而在CD19-CAR-T細胞治療中因不表達CD19抗原而逃避殺傷作用。另一個導致CD19陰性復發原因可能是:在CAR-T細胞治療后，由于CD19陽性細胞被殺滅,導致CD19陰性細胞大量增殖而導致白血病復發[16]。所以CAR-T治療后微小殘留白血病(minimal residual disease，MRD)的監測不應該局限于CD19陽性細胞，監測CD19陰性細胞細胞的免疫表型變化也尤為重要。對于CD19陰性復發，重新輸注將沒有用，因為B-ALL不再表達目標[15]。(2)CD19陽性復發中，多因T細胞功能較差或早期輸注CAR-T細胞后CAR-T細胞消失導致，其中較為罕見的原因是譜系轉化，另一個原因可能與CAR-T細胞內的共刺激結構域有關[17]。這些患者中，重新輸注CAR-T細胞可能會有所幫助。

2.CD19-CAR-T細胞治療后復發對策：(1)對于CD19陽性復發患者，CD19-CAR-T細胞經過共刺激信號分子改造后，可實現CAR-T細胞擴增。(2)而對于CD19陰性患者采用多種標志物的共靶向CAR-T治療，CD19不是CAR-T細胞的獨特有效靶標，CD22表達于大多數B細胞性急性淋巴細胞白血病患者，包括在CD19定向免疫療法后發展CD19免疫逃逸的大多數患者保留CD22表面表達，并且白血病仍然對免疫治療敏感。(3)同種異體移植治療，造血干細胞移植是目前唯一可以治愈B-ALL的方法，在患者獲得完全緩解后橋接造血干細胞移植。

3.CD22-CAR-T細胞治療特點：(1)CD22也在大多數B-ALL病例中表達，并且通常在CD19喪失后保留。Fry等[15]的臨床試驗表明，在接受CD22-CD19-CAR-T細胞治療的患者中，有73%(11/15)獲得完全緩解，包括CD19陰性復發的5例患者。(2)CD22-CAR-T細胞具有與CD19-CAR-T細胞相似的安全性，且雙抗原的免疫治療，可以減少腫瘤通過抗原丟失逃逸的可能性。ChiCTR(Chinese Clinical Trial Registry, number ChiCTR-OPN-16008526)臨床試驗表明50例患者接受CD22-CD19-CAR-T細胞治療后，有48例(96%)在第30天評估時達到CR，其中94% MRD陰性，所有B-ALL患者的無進展生存期(progression-free survival,PFS)為12.0個月[18]。(3)數據證明了CD22-CD19-CAR-T細胞產生了有效的抗白血病活性，即使產生了適度的CRS，但在CD22-CD19-CAR-T細胞治療后沒有顯示脫靶毒性的證據。(4)CD22-CART細胞也有效遷移至腦脊液，但尚未未觀察到嚴重神經毒性或癲癇發作的證據[19，20]。(5)同時靶向B-ALL表面上的兩種抗原可降低抗原丟失變體的可能性。

4.CD22-CD19-CAR-T細胞治療后復發及復發后對策：(1)Fry等的臨床試驗表明，在CD22-CAR-T細胞治療緩解后復發的8例患者中發現有7例患者存在CD22位點密度降低，這與潛在的細胞遺傳學亞型有關，可能使CD22+細胞逃脫CD22-CART細胞的殺傷。(2)在達到CR的12例患者中，有8例患者在輸注CD22-CAR-T細胞后1.5～12.0個月(中位數6個月)復發，并且有7例患者發現CD22表面表達減少，而不是表面表達的完全喪失，足以使CD22定向的CAR治療中的白血病逃逸[15]。(3)實際上，B-ALL上CD19和CD22的表達水平在患者與患者之間可能是異質的，復發時可能發生免疫表型改變，特別是在靶向治療時代。因此，CAR-T細胞的雙重靶向可以是更廣泛的活性療法，其可以解釋抗原表達的基線變異性和隨時間發生的變化。采用多種抗原免疫治療及同種異體移植可減少抗原丟失逃逸帶來的復發。(4)在先前CD19和CD22定向治療失敗的患者中，應盡早考慮造血干細胞移植而不是等到復發[15，18]。

四、展 望

因造血干細胞移植依賴于尋找MHC匹配供體的能力以及避免可能危及生命的感染和移植物抗宿主病等并發癥等特點，且CAR-T細胞治療B-ALL可獲得分子學緩解，有完善的治療方案應對CAR-T細胞治療后所產生的不良反應，CD19和CD22雙靶抗原治療解決了CD19治療后復發的部分問題[21]。因此，CAR-T細胞的雙重靶向可以是更廣泛的活性療法，其可以解釋抗原表達的基線變異性和隨時間發生的變化。最后，雙靶向B-ALL表面上的兩種抗原可降低抗原丟失變體的可能性，已經進入臨床實踐，取得了滿意的療效，有望成為B-ALL復發的新方案。