我國豬用病毒類生物制品質量情況分析及建議

吳華偉，陳曉春，秦義嫻，高金源，李俊平，鄧永，曹明慧，高月異

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

我國作為世界上最大的生豬生產國和消費國，生豬產業體量巨大。據統計[1-2]，我國生豬養殖量約占世界生豬總養殖量的60%，豬肉消費量約占世界豬肉消費量的50%，豬肉在中國國內肉類產量和消費量占比均超過60%，生豬飼養產值接近1.3萬億。隨著我國生豬養殖規模的日益擴大，豬病發生率也逐漸上升，呈現老病滅不盡，新病又發生的現狀，嚴重威脅養豬業的健康發展。疫苗接種是預防和控制動物病毒性疾病最經濟和最有效的手段，其質量的好壞事關重大動物疫病防控成效和養殖業健康發展，事關動物產品質量安全和公共衛生安全。本文對我國豬用病毒類生物制品現狀及2008-2017年豬用病毒類生物制品的質量情況進行總結，分析存在的問題，提出做好豬用病毒類制品質量控制的建議。

1 我國豬用病毒類生物制品基本現狀

1.1 主要種類 目前，我國豬用病毒類生物制品主要有4類：(1)疫苗類：包括活疫苗(傳統弱毒活疫苗和基因缺失活疫苗)、滅活疫苗(如全病毒滅活疫苗、亞單位疫苗、合成肽疫苗、基因缺失滅活疫苗等)以及細菌和病毒的聯苗。(2) 抗體類：包括卵黃抗體、高免血清、單克隆抗體類。(3) 診斷制品類：抗體檢測試劑或試劑盒(如ELISA試劑盒、瓊脂擴散抗原、HI抗原、乳膠凝集抗原等)以及抗原或核酸檢測試劑或試劑盒(如ELISA試劑盒、膠體金試紙條、PCR或RT-PCR試劑盒等)。(4)其他類：促性腺激素釋放因子類似物、干擾素、豬脾轉移因子等。

1.2 生產和銷售情況 據中國獸藥協會統計[3]，截至2017年年底，豬用生物制品共有有效文號515個，實際使用的391個，批準文號使用率為75.92%，其中豬用生物制品產品文號數量較多的產品為豬瘟活疫苗、偽狂犬活疫苗、仔豬副傷寒活疫苗、豬敗血性鏈球菌病活疫苗、仔豬大腸埃希氏菌病三價滅活疫苗和豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗。從銷售額看，豬用生物制品銷量為70.46億頭份/億毫升，總銷售為52.64億元，約占獸用生物制品總銷售額的39.39%；其中豬用強制性免疫疫苗銷售額為12.89億元，占所有強制性免疫疫苗銷售額的21.96%以及豬用生物制品總銷售額的24.49%，其中豬圓環病毒2型滅活疫苗、偽狂犬病活疫苗(Bartha-K61株)、豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗銷售額均超億元，總銷售額約12.21億元。

1.3 臨床試驗和新獸藥審批情況 從臨床試驗和新獸藥審批的情況看，近年來豬用生物制品研究已成為熱點。從臨床試驗批準的數據看(圖1)，2013年至2017年8月31日，農業農村部共批準臨床試驗376個，其中豬用生物制品164個，約占已批準臨床試驗的43%；批準的豬用生物制品臨床試驗中，豬用病毒類生物制品115個，約占豬用生物制品批準量的70%。從新獸藥審批的情況看(圖2)，2013-2017年農業農村部共新批準各類獸用生物制品285個，其中豬用生物制品為52個，約占總批準品種的18%；批準的豬用生物制品中，豬用病毒類生物制品33個，約占豬用生物制品批準量的64%。

數據來源于中國獸藥信息網上國家獸藥基礎數據庫，2018年數據截至8月31日圖1 2013-2018年獸用生物制品臨床試驗批準件數Fig 1 The number of approved clinical trials of veterinary biologics from 2013 to 2018

數據來源于中國獸藥協會網站公布的行業統計數據圖2 2013-2017年新批準各類獸用生物制品數量統計Fig 2 The number of approved new veterinary biologics from 2013 to 2017

2 2008-2017年我國豬用病毒類生物制品質量情況分析

為了解我國豬用病毒類制品的質量情況，對2008-2017年中國獸醫藥品監察所(以下簡稱“中監所”)承擔的所有類別(包括注冊檢驗、復核檢驗和監督檢驗)的豬用病毒類生物制品檢驗情況進行了匯總，并對檢測出的不合格批次及檢驗項目進行了統計分析。

2.1 不合格批次及主要不合格項目情況 由圖3、圖4和圖5可知，2008-2017年，豬用病毒類制品共檢出不合格產品96批，年均不合格批數約為10批，不合格項目涉及外源病毒檢驗、支原體檢驗、效力(效價)檢驗、安全檢驗、敏感性檢驗、特異性檢驗、總蛋白含量測定、無菌檢驗、甲醛含量測定和剩余水分測定等10個參數，其中主要不合格項目集中在純凈性檢驗(外源病毒檢驗、支原體檢驗和無菌檢驗)、效力(效價)檢驗和安全檢驗三個方面，尤其以純凈性檢驗中的外源病毒檢驗和支原體檢驗項目為主要不合格項目。

圖3 2008-2017年豬用病毒類生物制品不合格批次逐年分布Fig 3 The annual distribution of unqualified swine virus biologics from 2008 to 2017

圖4 2008-2017年各類豬用病毒類生物制品不合格批次匯總情況Fig 4 The batches of different test parameters for unqualified swine virus biologics from 2008 to 2017

圖5 2008-2017年各類豬用病毒類生物制品不合格項目占比情況統計Fig 5 The percentage of different test parameters for unqualified swine virus biologics from 2008 to 2017

從不合格批次排名前4位的檢驗項目看，外源病毒檢驗31批、支原體檢驗19批、效力檢驗17批，安全檢驗7批，分別占所有不合格項目的比例為32.3%、19.8%、17.7%和7.3%，4項合計占所有不合格項目的比例為77%。從該4項主要不合格項目逐年分布情況看(圖6)，外源病毒檢驗不合格是目前各類檢驗最突出問題，其次為效力檢驗、支原體檢驗和安全檢驗。敏感性檢驗和特異性檢驗作為診斷試劑制品的主要質量控制參數，2008-2017年共檢出不合格產品9批，約占所有不合格項目的9.4%；而總蛋白含量測定、無菌檢驗、甲醛含量測定和剩余水分測定等4個項目不合格批次基本一致，合計占所有不合格項目的比例為13.5%。

圖6 2008～2017年豬用病毒類生物制品主要不合格項目逐年分布情況Fig 6 The annual distribution of major unqualified parameters for unqualified swine virus biologics from 2008 to 2017

2.2 不合格風險較高產品 從不合格批次排名前4位的項目對應的具體產品情況看(表1)，各種病毒類活疫苗的外源病毒檢驗和支原體檢驗不合格的風險均較高，效力檢驗不合格產品主要集中在批簽發數量較多且市場需要較大的豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗、豬圓環病毒2型滅活疫苗以及豬流性行腹瀉類疫苗，而安全檢驗不合格產品主要為偽狂犬病活疫苗豬和豬細小病毒病滅活疫苗。

表1 豬用病毒類生物制品主要不合格項目風險較高產品Tab 1 The major risk products of unqualified parameters for swine virus biologics

2.3 不合格批次在各類檢驗中逐年分布情況 由圖7可以看出，2008-2009年不合格批次主要集中在監督檢驗方面，2010年開始注冊檢驗不合格批次一直持續存在且處于較高水平(2012年、2015年和2017年均為當年不合格主要因素)，但從2014年開始文號復核試驗不合格批次持續存在并與注冊檢驗一并成為不合格批次的主要來源，而監督檢驗不合格批次逐年減少，呈現較穩定狀態。由此可見，目前新制品注冊檢驗和文號復核檢驗是豬用病毒類生物制品不合格批次的主要來源，提示必須加強新制品及文號復核樣品的質量控制。

2.4 各類檢驗的主要質量風險點 從豬用病毒類生物制品不合格項目在各類檢驗中的分布情況看(圖8)，外源病毒檢驗和效力檢驗是各類檢驗都應密切關注的主要質量風險點，支原體檢驗、效力檢驗、無菌檢驗、剩余水分檢驗和總蛋白測定(主要為口蹄疫滅活疫苗)是監督檢驗需重點關注的質量風險點，安全檢驗、甲醛含量測定以及診斷試劑類的敏感性檢驗和特異性檢驗是注冊檢驗的主要質量風險點。需指出的是，外源病毒檢驗是豬用病毒類制品各類檢驗不合格的主要質量風險點，也是近幾年各類檢驗中暴露問題最集中的檢驗項，必要引起高度重視。

圖7 2008-2017年豬用病毒類生物制品不合格批次在各類檢驗中的逐年分布情況Fig 7 The annual distribution of unqualified items for swine virus biologics in various tests from 2008 to 2017

圖8 2008-2017年豬用病毒類生物制品不合格項目在各類檢驗中的分布Fig 8 The batches distribution of unqualified parameters for swine virus biologics in various tests from 2008 to 2017

3 關于做好豬用病毒類制品質量控制的建議

3.1 以動物源性原輔材料質量控制為重點，加強外源病毒檢驗 血清、胰酶、細胞、含有動物源性成分的培養基等原輔材料是獸用生物制品生產和檢驗中必不可少的基礎物質，也是造成制品外源病原污染的重要來源。如牛血清中經常會污染BVDV、呼腸孤病毒，豬源胰酶中污染PCV1、PPV、TGEV等[4]。從近10年豬用病毒類生物制品檢驗結果看，外源病毒檢驗不合格是各類檢驗中存在的最突出問題，也是近年來檢驗不合格項目的主要風險點。目前，我國獸用生物制品中常規外源污染(如BVDV、PPV、RHDV等)已得到充分重視，但對于原輔材料(如牛血清、胰酶、細胞、哺乳動物細胞用培養基等)的控制尚未引起足夠關注，存在較為嚴重的質量風險隱患。如2015版《中國獸藥典》僅制定了牛血清、生產用細胞(細胞系)的質量標準，但缺乏使用量較大的胰酶、動物細胞用培養基以及檢驗用細胞的質量標準，造成相關原輔材料控制無標準可依，或者企業制定的原輔材料內控標準缺乏針對性，無法起到質控目的。需要注意的是，檢驗用細胞作為外源病毒檢驗的最重要基質，其質量情況對檢驗結果也有直接影響。研究表明[5]，不同來源的相同細胞敏感性差異較大，如適應PCV2培養的PK15必須經特殊克隆篩選才能適應病毒增殖。因此，采用不同來源的細胞進行外源病毒檢驗，也可能造成檢驗結果的差異。但《中國獸藥典》(2015年版)對檢驗用細胞尚無質量標準，各企業在進行外源病毒檢驗時采用的細胞差異也較大，細胞的來源也不盡相同，甚至背景不清楚，且多數企業未對檢驗用細胞按規定進行系統鑒定、代次控制并建立種子批。因此，建議應盡快制定完善胰酶、動物用細胞培養基以及檢驗用細胞質量標準，并由中監所統一制備并供應外源病毒檢驗的細胞(如MDBK、ST、Vero細胞等)，并限定其代次使用范圍，以實現全行業檢驗結果的一致性，為提升獸用生物制品質量提供可靠保障。

3.2 以獸用生物制品標準物質研究為重點，夯實獸用生物制品檢驗物質基礎 獸用生物制品標準物質主要用于獸用生物制品效價、活性和含量等質量檢驗或對其特性鑒別、檢查或技術驗證。豬用病毒類生物制品的標準物質主要有生產和檢驗用標準毒株(如生產用豬瘟兔化弱毒株以及檢驗用石門系豬瘟強毒株)、抗血清或單克隆抗體、參考疫苗(如PCV2參考疫苗)、抗原(如PPV HI抗原)以及診斷試劑(如PPV熒光抗體)等，其中特異性抗血清效價不高、特異性差是影響豬用病毒類活疫苗外源病毒檢驗和病毒含量測定(特別是對于多聯或多價活疫苗)結果以及造成檢驗結果不合格的主要因素。與先進國家相比，目前我國提供的非禽源標準抗血清和診斷用試劑種類還比較少，質量參差不齊，且獸用生物制品行業使用的抗血清大都是多克隆抗體，單克隆抗體較少。這些日益成為制約我國獸用生物制品行業持續、健康發展的瓶頸，亟待進一步加大我國獸用標準物質研制和引進力度，盡快解決困擾獸用生物制品行業的基礎性物質短缺問題。建議應進一步加強對新批準獸用生物制品相關標準物質的審查力度，特別是加強對研制單位研制數據的核查機制，新制品審批時堅持制品申報資料與相應標準物質研制資料并重，復核檢驗時堅持對制品及相關標準物質同時進行檢驗，強化制品研制單位將標準物質足量指定保存與農業農村部新獸藥證書核發的關聯機制，并建立標準物質強制換批要求及換批不及時的懲處機制，以確保新制品上市后檢驗時標準物質的足量、有效供應。同時，建議國家獸藥監管部門牽頭，整合國內研究和生產單位現有資源，以建立我國獸用生物制品檢測用單克隆抗體試劑庫為切入點，指定生產單位定點生產，由中監所統一鑒定并對外供應，實現資源和利益共享，并逐步建立和完善其他檢測用標準物質的生產-供應新模式[6]，不斷夯實獸用生物制品物質基礎。

3.3 以檢驗關鍵參數新技術和新方法研究為重點，提升獸用生物制品質量檢測水平 近年來，各種檢驗新技術、新方法不斷涌現，獸用生物制品檢驗也理應與時俱進，兼收并蓄。從2008-2017年豬用病毒類生物制品檢驗不合格項目看，外源病毒檢驗、支原體檢驗和效力檢驗是目前豬用病毒類生物制品的主要質量風險點，可以嘗試研究或引進新的檢驗技術或方法。

一是在外源病毒檢驗方面，可借鑒OIE國際貿易指定試驗或各國的農業國家標準推薦的PCR方法作為現有檢驗方法的必要補充，特別是在取代傳統方法難以檢測或針對新出現的病原的檢測(如非洲豬瘟病毒)。目前，我國部分獸用生物制品已經開始使用分子生物學方法(PCR或RT-PCR)作為非禽源外源病毒檢測的補充方法，如華中農業大學和中牧實業股份有限公司的豬偽狂犬病活疫苗(HB-98株)采用PCR方法檢測鄂A野毒株污染，青島易邦生物工程有限公司的豬脾轉移因子注射液采用RT-PCR檢測口蹄疫病毒污染。

二是在支原體檢驗方面，目前獸用疫苗使用的細胞(細胞系)、生產種毒以及制品支原體污染現象較為嚴重，而《中國獸藥典》(2015版)對于支原體的檢驗規定的方法僅有培養法一種方法[7]，該種方法檢驗周期較長，易受抗生素影響，且不能檢出所有的支原體污染，亟需增加新的方法進行補充和完善。實驗室常用的支原體檢驗方法除培養法外，還有DNA熒光染色法、PCR方法、ElISA(抗原)檢測法、血清學方法、形態學檢查(電鏡檢查)等[8]，其中培養法和DNA熒光染色法也是美國9CFR、歐洲藥典和我國藥典普遍采用的方法。DNA熒光染色法具有可以檢測所有支原體污染且不受抗生素影響的優點，PCR方法以其高敏感性、快速等特點被廣泛應用于實驗室支原體檢驗的日?？刂?。三種支原體檢驗方法的比較見表2。建議參考美國9CFR、歐洲藥典和我國人藥典的相關標準，在目前《中國獸藥典》(2015版)培養法的基礎上，增加DNA熒光染色法作為法定方法之一，同時鼓勵企業在按照《中國獸藥典》規定的培養法方法進行支原體檢驗外，可在內控標準中增加一些快速、通用的檢測方法，如DNA熒光染色法或PCR方法，將支原體控制的關口前移，防患于未然。

表2 三種支原體檢測方法的比較[11]

3.4 以制定通用的標準操作程序為重點，規范全行業獸用生物制品檢測 與國外獸用生物制品發達國家相比，目前我國的獸用生物制品檢驗尚缺乏全行業通用的標準操作程序，在具體檢驗過程中，對于一些共性的檢測項目(如無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗等)采用的細胞來源和代次、設備的型號和參數以及操作程序也各不相同，甚至是同一個產品的相同檢驗參數在不同的企業進行具體檢驗時檢測程序也不盡相同，不利于產品質量的控制及檢驗結果的橫向比較。特別是在目前新建獸用疫苗企業已超過100家且有可能繼續增加的新形勢下，如何盡快提升行業從業人員的檢驗技術和能力，如何維持好來之不易的獸用生物制品較為穩定的質量形勢，是獸藥監察系統必須面對和亟待破解的難題。近年來豬用病毒類生物制品檢驗結果也印證了此點，不合格產品和批次較多的企業絕大多數為新建企業，其不合格項目涵蓋了獸用生物制品檢驗的各個參數，甚至是無菌檢驗、支原體檢驗等常規檢驗項目。為此，可參照美國獸醫服務局規章第800.93號的做法，在中監所目前制定的《獸用生物制品檢驗操作規程》基礎上，盡快編制我國獸用生物制品質量檢驗標準操作規程，發布后印發全行業執行，做到全行業一套標準檢驗程序，促進獸用生物制品檢驗工作的標準化、程序化、規范化。同時，可定期組織行業能力比對，及時向社會通報比對結果，并考慮將能力比對結果與行業日常監管結合起來，促進生產企業自覺提高檢驗能力和水平。