替米考星固體分散體的制備與物相鑒定

巴娟，張勇軍,鄧樺,楊少林,李進,楊鴻*

(1.佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東佛山 528231；2.廣東養寶生物制藥有限公司，廣東佛山 528300)

替米考星(Tilmicosin)是一種以泰樂菌素為前體半合成的大環內酯類畜禽專用抗生素[1]。替米考星對革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌、支原體、螺旋體等均有良好的抑制作用，對胸膜肺炎放線菌、巴氏桿菌具有比泰樂菌素更強的抗菌活性，與臨床常用抗生素無交差耐藥性[2]。替米考星在水中極難溶解，具有較強的苦味，口服對胃部黏膜有刺激，生物利用度較低，在獸醫臨床上主要通過拌料給藥，由于動物患病時易食欲不振，不能起到及時治療疾病的作用，導致其在獸醫臨床上推廣應用受到限制。固體分散體技術是將難溶性藥物以微晶態、膠態、無定形態或分子狀態高度分散在載體材料中的新型制劑技術，固體分散體技術可以提高難溶性藥物的體外溶出速率，以改善藥物的吸收和生物利用度[3-5]。為增加替米考星的水溶性，提高其生物利用度，方便飲水給藥，及時治療疾病，本試驗選用PEG6000和P188作為載體，采用熔融法制備替米考星固體分散體，旨在制備一種穩定、速溶的替米考星固體分散體制劑，給養殖業帶來更大的方便以及利益。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 替米考星對照品(含量93.9%，批號：K0311407，中國獸醫藥品監察所)；替米考星原料藥(含量95.86%，批號：T2017127043，寧夏泰瑞制藥有限公司)；聚乙二醇6000(PEG6000，批號：EK170713，上海伊卡生物技術有限公司)；泊洛沙姆188(P188，巴斯夫(中國)有限公司)；磷酸、甲醇、乙腈、二正丁胺、四氫呋喃均為色譜純。

1.2 儀器設備 LC-15C高效液相色譜儀(島津企業管理(中國)有限公司)；MS-H-Pro+磁力攪拌器(大龍興創實驗儀器有限公司)；RC-3溶出度測定儀(天津市新天光分析儀器技術有限公司)；X射線多晶衍射儀(德國Bruker D8 ADVANCE)；Bruker Vertex傅里葉變換紅外光譜儀(德國Bruker公司)。

1.3 替米考星含量測定方法的建立

1.3.1 色譜條件 色譜柱：C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為水∶乙腈∶磷酸二丁胺∶四氫呋喃(805∶115∶25∶55)；檢測波長280 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min。

磷酸二丁胺溶液(1 mol/L)：取二正丁胺168 mL，加10%磷酸溶液700 mL，邊加邊攪拌，放冷后，用磷酸調節pH值至2.5±0.1，加水至1000 mL。

1.3.2 線性關系考察 精密稱量25 mg替米考星對照品，置于50 mL量瓶中，加入10 mL乙腈，超聲溶解，用10%磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，制備成500 μg/mL的儲存液。分別取儲存液0.1、0.5、1、2、3、4、5、6 mL于10 mL容量瓶中，用10%磷酸溶液稀釋至刻度，得到5、25、50、100、150、200、250、300 μg/mL的稀釋液，分別取各濃度稀釋液20 μL進樣，記錄色譜圖峰面積，以替米考星溶液的濃度對峰面積作線性回歸，得到線性回歸方程為y=27767x-55380(r2=0.9999)，替米考星濃度在5～300 μg/mL范圍內，與峰面積線性關系良好。

1.4 替米考星固體分散體的制備

1.4.1 載體篩選 分別取處方(表1)中的載體置于燒杯中，57 ℃水浴加熱至完全熔融，按處方加入替米考星，邊加邊攪拌，使替米考星完全融于介質中。攪拌2 h后從水浴中取出燒杯，迅速倒入預冷的不銹鋼托盤中，然后轉移至-20 ℃的冰箱固化4 h，取出置35 ℃鼓風干燥箱干燥24 h，從托盤中取出，研碎，過80目篩，置干燥器避光保存[6-8]。

表1 替米考星固體分散體配方Tab 1 Formulation of the tilmicosin solid dispersion

1.4.2 正交試驗設計 通過載體篩選等單因素考察后，按照正交設計表L9(34)，以三因素藥載比(A)、攪拌時間(B)、固化時間(C)三水平進行設計(表2)，以累積溶出度為指標篩選出替米考星固體分散體的最佳制備工藝。

表2 正交試驗設計因素和水平Tab 2 Factors and levels of orthogonal design

1.5 溶出度測定 按獸藥典中的槳法測定藥物溶出度[9]。取替米考星固體分散體適量(相當于替米考星原藥100 mg)，溶出介質為經脫氣處理的蒸餾水900 mL，溫度37 ℃，轉速100 r/min，分別于2、5、10、15、20、30、45、60 min時定量取樣5 mL，同時補充等量同溫介質5 mL，經0.22 μm微孔濾膜過濾，高效液相色譜法分別測定峰面積，代入標準回歸方程，計算藥物的累積溶出度。同一樣品連續測定3次。

1.6 固體分散體物相鑒定 參照固體分散體表征手段[10]，本試驗選用X-射線衍射、傅里葉變換紅外光譜用于替米考星固體分散體的物相鑒定。

1.6.1 X射線衍射法 將替米考星原料藥、載體、物理混合物、固體分散體研碎過80目篩，進行X射線衍射分析，檢測依據為JY/T 009-1996轉靶多晶體X射線衍射方法通則。測試條件：Cu靶，PIXcel ID探測器，Ni濾波片，電壓：40 kV，電流：40 mA，角度范圍：3°～60°，掃描速度：12°/min，取適量樣品填充樣品槽，壓實刮平，使用正裝法進樣，分別進行X射線衍射分析。

1.6.2 紅外光譜法 將替米考星原料藥，載體，物理混合物、固體分散體研碎過80目篩，進行傅里葉紅外光譜的分析，檢測依據為GB/T 6040-2002紅外光譜分析方法通則，分別取適量樣品與KBr混合后壓片，在400～4000 cm-1進行紅外掃描，分辨率4 cm-1，掃描次數32次，進行紅外光譜分析，記錄圖譜。

2 結果與分析

2.1 載體篩選結果分析 由累積溶出度圖(圖1)可知，選用PEG6000單一載體制備替米考星固體分散體，溶出速率并不是太快，2 min時溶出度只達到20%，隨著載體P188比例的增加，固體分散體的溶出速率越快，累積溶出度越高。但實際制備過程中，隨著載體P188比例的增加，固體分散體的粘性越大，易粘結成團。最終試驗選用聯合載體PEG6000∶P188=20∶1制備替米考星固體分散體，提高溶出速率的同時，也能夠避免單一載體制備替米考星固體分散體出現的缺陷。

圖1 累積溶出度圖Fig 1 Chart of cumulative dissolution

2.2 正交試驗與溶出度結果 根據正交試驗結果(表3)可知，A3>A2>A1，B1>B3>B2，C3>C1>C2，最優制備工藝為A3B1C3，即藥載比1∶3，攪拌時間1 h，固化時間12 h。此制備工藝制備的替米考星固體分散體在2 min時溶出度達到71.8%，15 min時可完全溶解，顯著提高了替米考星的溶出速率。

表3 正交試驗結果Tab 3 Results of orthogonal experiment

2.3 X射線衍射分析 由圖2可知，替米考星在低角度出現一些衍射峰疊加在一起，沒有特征衍射峰出現，說明替米考星是非晶態，是一種無定型物質。聯合載體、物理混合物、固體分散體在衍射角19°和23°處分別具有較強的衍射特征峰，但物理混合物、固體分散體的衍射峰都有降低，說明載體為晶體結構，替米考星主要以無定型狀態分散在載體中，替米考星固體分散體為晶體結構，這與其他文獻中報道的檢測結果一致[11]。

圖2 X射線衍射圖譜Fig 2 Results of X- ray diffraction

2.4 傅里葉紅外光譜分析 參照文獻中替米考星、PEG6000和P188紅外光譜圖分析[11-13]，由紅外光譜圖(圖3)可知，替米考星在3452cm-1處具有一個較寬吸收峰，是游離的羥基伸縮振動吸收峰，在2933～2836 cm-1處具有吸收峰，是-CH3、-CH2的伸縮振動峰，在1741、1679 cm-1處具有稍弱吸收峰，是碳碳雙鍵與羰基的不飽和伸縮振動吸收峰，在1593cm-1、1457cm-1有尖銳吸收峰，是N-H和C-H的振動吸收峰，在1168、1083 cm-1處有較強吸收峰，是C-O和C-O-C的伸縮振動吸收峰。

A為替米考星，B為聯合載體，C為替米考星和聯合載體物理混合物，D為替米考星固體分散體圖3 紅外光譜圖Fig 3 Fourier infrared spectroscopy

通過對比替米考星、載體與固體分散體紅外光譜圖，固體分散體中的替米考星在3452 cm-1處的吸收峰發生了移動，而且吸收峰的強度明顯降低，在1741、1679、1593 cm-1處的吸收峰明顯降低，在1457 cm-1和1168 cm-1的吸收峰已經消失。載體的特征吸收峰基本都在，并且無較大變化，說明替米考星已分散于載體中，為替米考星固體分散體的形成提供參考依據。

3 討論與結論

近幾年來，有人在替米考星制劑的研究中采用了微囊、納米乳、包合物、脂質體等新技術，在一定程度上，提高了藥物的溶解度，掩蓋了替米考星的苦味，并且具有緩釋、靶向的作用[14-16]。但是大部分技術需要加入大量有機試劑，難以除盡，存在成本較高、步驟繁瑣、污染環境等問題，因而限制了增溶新技術在替米考星制劑實際生產中的應用。

熔融法制備固體分散體時，不需要加入有機試劑，且制備工藝簡單。目前固體分散體的老化現象限制了該技術在工業生產和臨床上的應用，可以通過調整載體理化性質、采用聯合載體、改善貯存環境等因素提高固體分散體的穩定性。PEG6000是一種水溶性高分子聚合物，具有良好的水溶性和生物相容性，而P188是一種非離子型表面活性劑，載藥量大，能抑制產品結晶[17-18]。

本試驗分別選用了PEG6000和P188作為載體制備替米考星固體分散體，結果發現PEG6000作為載體制備的固體分散體質地硬，溶出速率稍慢，2 min時溶出度達到20%，而P188作為載體制備的固體分散體質地較軟，粘性大，流動性差，但溶出速率較快，2 min時溶出度達到70%。P188價格也較為昂貴，綜合各因素考察，試驗選用PEG6000和P188聯合載體，經過篩選，選用PEG6000∶P188=20∶1制備替米考星固體分散體，通過正交試驗對制備工藝進行優化，X射線衍射法和傅里葉紅外光譜法也說明替米考星固體分散體形成，替米考星以無定型態分散于載體中。該制備工藝簡單，避免了單一載體制備替米考星固體分散體出現的缺陷，提高溶出速率的同時，又能降低經濟成本，替米考星固體分散體易溶于水，方便飲水給藥，可及時治療疾病，給養殖業帶來更大的方便以及利益。