兔病毒性出血癥滅活疫苗效力檢驗替代方法研究

高金源，劉丹，陳建，秦義嫻，郎洪武

(中國獸醫藥品監察所，北京100081)

兔病毒性出血癥(Rabbit Haemorrhagic Disease, RHD)是由兔出血癥病毒(RHDV)引起的一種家兔高發病率、高死亡率的傳染性疫病，臨床多表現為發熱、精神不振、突然死亡，疫苗接種仍是預防RHD的最有效方法[1-2]。

在《中國獸藥典》2015年版三部中[3]，RHD滅活疫苗效力檢驗采用經典的家兔免疫攻毒方法來評價家兔攻毒后的保護效果。由于該方法需要配備負壓動物舍，攻毒后也需要較長觀察時間,存在試驗成本高、周期較長、操作繁瑣等缺點。本試驗在制備了HI試驗用RHDV 血凝(HA)抗原、陽性血清、陰性血清的基礎上，確認了免疫攻毒保護與免疫血清HI抗體效價之間的平行關系，并采用免疫血清HI效價測定方法進行了RHD滅活疫苗的效力檢驗應用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 家兔 RHD血清抗體陰性(HI價<1∶8)的3月齡以上健康新西蘭兔，由濟源市陽光兔業科技有限公司、濟南西嶺角養殖繁育中心、四川省實驗動物專委會養殖場購入。

1.1.2 RHDV AV34株肝臟組織毒，由齊魯動物保健品有限公司(毒價為105.0LD50/mL)、華派生物工程集團有限公司(毒價為105.1LD50/mL)、山東綠都生物科技有限公司(毒價為106.1LD50/mL)及中國獸醫藥品監察所病毒室(毒價為105.5LD50/mL)提供。

1.1.3 1%新鮮人“O”型紅細胞 由齊魯動物保健品有限公司、華派生物工程集團有限公司提供。

1.1.4 RHD滅活疫苗 規格為20 mL(頭份)/瓶，由齊魯動物保健品有限公司(9批，批號分別為1702007、1702008、1704019、1704020、1706023、1706024、1707029、1708037、1708038)、華派生物工程集團有限公司(8批，批號分別為2017001～2017008)、山東綠都生物科技有限公司(2批，批號分別為1803003、1804004)提供。

1.1.5 RHDV HA抗原 (HA價為1∶128)、RHD陽性血清(HI價為1∶128)、RHD陰性血清(HI價<1∶8)、PBS(0.01 mol/L，pH7.2)、硫乙醇酸鹽流體培養基、胰酪大豆胨液體培養基，均由中國獸醫藥品監察所病毒室提供。

1.2 方法

1.2.1 RHDV HA抗原制備 用RHDV南京株接種3月齡以上的健康易感家兔，無菌采集接種后24～96 h瀕死或剛死兔的有典型病理變化的肝臟；將肝臟組織用適量的PBS進行搗碎，6000 g離心15 min，取上清液，制備成8倍稀釋的病毒懸液；加入β-丙內酯溶液，使其含量為1/4000，混合均勻，放入4 ℃冰箱作用24 h，再放入37 ℃水浴水解2 h，放入4 ℃冰箱保存。同時進行無菌檢驗[2]和HA效價測定[1]。無菌檢驗結果應無菌生長，滅活病毒HA價應不低于1∶64。

1.2.2 RHD陽性血清制備 采用常規微量HI試驗法[1]，選取RHD抗體陰性(HI價<1∶8)的3月齡以上的健康家兔，先用商品化的RHD滅活疫苗進行基礎免疫，再用RHDV強毒加強免疫2次，中間間隔14 d，最后一次免疫后21 d，無菌采集血液，提取血清，混合后進行無菌檢驗和HI效價測定。無菌檢驗結果應無菌生長，HI價應不低于1∶128。

1.2.3 RHD陰性血清制備 采用常規微量HI試驗法，選取RHD抗體陰性(HI價<1∶8)的3月齡以上的健康家兔，無菌采集血液，提取血清，混合后進行無菌檢驗和HI效價測定。無菌檢驗結果應無菌生長，HI價應小于1∶8。

1.2.4 疫苗免疫攻毒與血清HI效價的平行關系 采用常規微量HI試驗法，選取RHD抗體陰性(HI價<1∶8)的3月齡以上的健康家兔35只。將RHD滅活疫苗搖勻后進行家兔免疫，取1/2 頭份、1/4頭份、1/8頭份疫苗各皮下注射家兔10只，飼養觀察14 d。同時設立非免疫攻毒對照家兔5只。家兔免疫14 d后，對所有試驗家兔進行采血，每只家兔采血4.0 mL，提取血清，56 ℃滅活30 min，用于血清HI價測定。家兔采血后，對所有家兔進行攻毒，每只家兔皮下注射RHDV 1 mL(含1000 LD50/mL)。每日觀察家兔健康情況，飼養觀察7 d，記錄家兔發病死亡情況；同時，無菌采集免疫攻毒家兔肝臟組織，研磨并稀釋4倍后，3000 g離心15 min后，取上清液測定血凝情況，以監測RHDV兔體內復制增殖情況。攻毒對照家兔應至少死亡4只，試驗成立。統計不同HI效價的攻毒保護情況，當免疫攻毒保護家兔4倍肝臟組織液無血凝性時，以免疫攻毒100%保護家兔的血清最低HI效價作為免疫攻毒保護判定的最低標準。

1.2.5 疫苗效力檢驗替代方法的應用 與3家企業19批RHD滅活疫苗現行免疫攻毒法同步進行，攻毒前無菌采集免疫家兔血液，提取血清，進行HI效價測定，根據1.2.4中確定的免疫攻毒保護判定標準，比較兩種方法的效力檢驗結果，評價HI效價測定方法替代現行免疫攻毒法的可行性。

2 結果與分析

2.1 RHDV HA抗原、陽性血清、陰性血清鑒定 結果見表1。HI法的各組分鑒定結果均符合其質量標準要求，可以滿足HI效價測定的需要。

2.2 疫苗免疫血清不同HI效價水平的免疫攻毒保護情況統計結果 見表2。

表1 HI法組分鑒定結果Tab 1 Identification results of HI component

“-”：檢測結果為陰性； “/”：不涉及

“-”： negative； “/”：unconcerned

表2 不同HI效價水平的攻毒保護結果Tab 2 Protection rate of rabbits with different HI titre levels

“-”代表保護；“HA-”代表無血凝

“-”protection; “HA-”no hemagglutination

攻毒對照家兔均發病死亡；免疫攻毒獲得保護家兔的4倍肝臟組織液均無血凝性，顯示無明顯病毒增殖情況；RHD滅活疫苗免疫家兔血清HI效價低于1∶16時(6份)，對應的攻毒家兔均發病死亡；免疫家兔血清HI效價為1∶16時(8份)，對應攻毒家兔5只獲得保護，而另3只均發病死亡；免疫家兔血清HI效價不低于1∶32時(21份)，對應的攻毒家兔均獲得保護。

2.3 疫苗效力檢驗替代方法的應用 疫苗效力檢驗現行方法(免疫攻毒法)與替代方法(HI效價測定方法)的應用結果比較見表3。

表3 2種效力檢驗方法應用結果比較Tab 3 Comparison of the two methods applicated in potency test

所有對照組家兔血清HI效價不高于1∶8，且在攻毒后均死亡；在19批RHD滅活疫苗效力檢驗的免疫攻毒方法與血清HI效價測定方法的比較應用試驗中，替代方法(HI效價測定方法)與現行方法(免疫攻毒法)檢驗結果符合率為100%。

3 結 論

RHD于1984年由我國首次報道[4]，隨后確認該疫病由杯狀病毒科杯狀病毒屬的RHDV引起。由于RHDV只能在兔體內增殖，不能在任何組織細胞上有效增殖[4]，因此，尚未建立在細胞上進行抗體定量檢測方法。雖然發現存在無血凝性的毒株[5]，但可以利用具有血凝性的RHDV毒株，通過血清HI效價的測定對家兔血清抗體進行定量[1,6-7]。同時，RHD滅活疫苗免疫血清HI效價與RHDV的攻毒保護密切相關，但免疫攻毒臨床保護的HI效價臨界值缺少明確一致的數據[8-10]。目前，RHD滅活疫苗效力檢驗的國內外標準方法均為免疫攻毒法[3,11]，雖然攻毒劑量要求不同，但均是通過觀察免疫家兔攻毒后是否獲得臨床保護來判定免疫效果。為了采用免疫血清HI效價測定方法替代現有的標準方法，按照《中國獸藥典》2015年版三部的攻毒劑量標準，明確了攻毒臨床保護的免疫血清HI效價標準應不低于1∶32。同時，與19批RHD滅活疫苗效力檢驗免疫攻毒的標準方法進行比對的應用表明，標準方法中免疫攻毒臨床保護的家兔，其免疫血清HI效價均未低于1∶32。可見，只要免疫血清HI效價不低于1∶32，就能夠確保免疫家兔攻毒后可獲得臨床保護，用免疫兔血清HI效價均不低于1∶32作為RHD滅活疫苗效力檢驗中判定攻毒臨床保護的標準確實可行。

在《中國獸藥典》2015年版三部中，RHD滅活疫苗的安全檢驗和效力檢驗均采用HI效價測定方法篩選檢驗用敏感家兔，生產企業熟悉該檢測方法。同時，通過免疫家兔血清HI效價來評價疫苗免疫效果，疫苗生產企業可以避免使用負壓動物舍，縮短檢驗時間，也可節約檢驗成本。該研究也可為下一版《中國獸藥典》的修訂提供數據。