動物源性食品中氟喹諾酮類藥物殘留色譜質譜檢測技術研究進展

郭亞文，卜曉娜，劉楚君，王雅娟，趙霞，王波，謝愷舟*

(1.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州 225009；2.教育部農業與農產品安全國際合作聯合實驗室，江蘇揚州 225009)

獸藥在保證動物源性食品的供應方面發揮著巨大作用，但由于飼養人員專業知識的缺乏造成藥物過量使用，以及不遵循休藥期，甚至片面地追求經濟利益而在養殖、加工貯存等過程中投入過量的抗菌藥物導致獸藥殘留超標[1]，后通過食物鏈進入人體造成中毒、過敏、“三致”(致癌、致畸、致突變)等嚴重傷害。因此，在動物源性食品進入市場前進行藥物殘留檢測是十分必要的，需嚴格控制藥物殘留達到最高殘留限量(Maximum residue limits，MRLs)以下。喹諾酮類藥物(Quinolones,QNs)是人工合成的含4-喹諾酮基本結構的抗菌藥，對DNA回旋酶有選擇性的抑制作用，從而對細菌DNA造成不可逆損害，對多種革蘭陰性菌殺菌效果明顯[2]。氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolones,FQs)是喹諾酮藥物發展到第三代的產物，在喹諾酮結構的6位上加上一個氟(F)，脂溶性增加，對組織細胞的穿透力加強，因而吸收好，組織濃度高，半衰期長，抗菌譜和殺菌效果增強。主要包括恩諾沙星(Enrofloxacin, ENR)及其代謝物環丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)，恩諾沙星在動物體內脫乙基生成環丙沙星，如豬體內ENR和CIP均有殘留，牛、家禽體內殘留形式以CIP為主，因此，動物性食品中ENR殘留檢測的標示物多是原藥及其代謝產物CIP之和，也包括諾氟沙星(Norfloxacin, NFX)、氧氟沙星(Ofloxacin,OFL)、單諾沙星(Danofloxacin,DAN，又名丹諾沙星、達氟沙星)、沙拉沙星(Sarafloxacin, SAR)等。此類藥物可用于泌尿生殖系統疾病、胃腸疾病以及呼吸道、皮膚組織的革蘭陰性菌感染的治療[3]，且價格低廉，已廣泛應用于動物養殖和獸醫學中。

近年來由于致病菌耐藥性和某些FQs的潛在致癌性，其殘留問題引起廣泛關注。為保證動物源性食品的安全，歐盟對ENR的MRLs已有規定，肝臟200 μg/kg，肌肉100 μg/kg，腎臟200 μg/kg；加拿大允許ENR用于治療牛呼吸道疾病，其MRLs為腎臟400 μg/kg和肌肉20 μg/kg；日本對進口生鰻魚及其制品進行ENR、CIP、NFX殘留檢測，并且將MRLs控制在50 μg/kg；世界衛生組織對ENR的MRLs推薦值為40 μg/kg，糧農組織/世界衛生組織食品添加劑聯合專家委員會推薦雞肝組織中SAR的MRLs為80 μg/kg，豬肝組織中DAN的MRLs為50 μg/kg[4]；中國對于ENR+CIP規定見表1[5]。目前FQs殘留的檢測方法較多，如微生物法、酶聯免疫法、毛細管電泳法等。由于FQs在動物源性食品中的殘留量通常很低，需要靈敏度高的檢測方法來測定，色譜法分離效率高，質譜法靈敏度、特異性高，適于低殘留藥物的檢測。本文綜述了色譜和質譜檢測方法，以期為動物源性食品中FQs的殘留檢測提供參考。

表1 中國關于動物源性食品中恩諾沙星、環丙沙星最大殘留限量的規定Tab 1 Maximum residue limits (MRLs) values for ENR, CIP in animal food established by China

1 液相色譜法

1.1 液相色譜法 液相色譜系統包括流動相和固定相，其中固定相可以是固體，也可以是被固體或凝膠所支持的液體，液相色譜法(Liquid chromatography, LC)利用混合物在液-固或互相不溶的兩種液體之間分配比的差異進行分離，而后分析鑒定。

Cho等[6]以LC法研究了豬肌肉、雞蛋、全脂牛奶中7種FQs殘留，定量限(Limit of quantitation, LOQ)為0.3～25 μg/kg，回收率為61.12%～115.93%。Roybal等[7]以LC法檢測牛奶中的ENR、SAR殘留，但色譜峰出現拖尾現象，且保留值不穩定或過長，甚至被長期保留在色譜柱上，導致峰形異常和分離度下降。這是由于FQs結構中某些基團如羧基團會在溶液中發生解離，進而影響固定相表面對FQs分子的吸附作用，因此，LC法檢測FQs類殘留不夠準確。

1.2 高效液相色譜法 大多數金屬鹽類和高沸點不易揮發、熱穩定性差的物質不能用LC分析，此缺點可用高效液相色譜法(High performance liquid chromatography, HPLC)來克服。高效液相色譜儀是在液相色譜系統中加上高壓液流系統，使流動相在高壓下快速流動，以提高分離效果。HPLC以液體為流動相，采用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析。色譜圖不能直接給出未知物的定性結果，必須由已知標準作對照定性。當無純物質對照時，定性鑒定十分困難，需借助檢測器的配合。檢測器的功能是將從色譜柱中流出的已經分離的組分顯示出來或轉換為相應的電信號，常見的檢測器包括熒光檢測器(Fluorescence detector, FLD)、二極管陣列檢測器(Diode array detector, DAD或Photo-diode array detector, PDAD)等。HPLC的最大優點是具有優秀的重復性和重現性，利用HPLC來檢測FQs殘留的方法已被國家標準采用。由于色譜柱的性能會隨著使用和不正確的保養而逐漸下降，會造成分離時間與色譜峰面積上的差異，因而在試驗過程中要保持色譜柱的良好使用狀態[3]。

Liu等[8]利用微波萃取輔助提取法對日本對蝦中的3種FQs殘留的檢測進行了優化，樣品加標回收率可達78.40%～96.62%。LV等[9]對蜂蜜中的OFL含量進行了檢測，其檢測限(Limit of detection, LOD)范圍為5.68～9.71 μg/kg。Patyra等[10]用鹽酸和乙腈提取樣品，然后在pH為4.0的0.01 mol/L草酸中稀釋并通過固相提取純化，LOD和LOQ分別為28.5～74.7 μg/kg和31.7～94.6 μg/kg，平均回收率為89.7%～100.3%。He等[11]檢測牛奶、雞肉和雞蛋中7種FQs殘留，LOD范圍在0.05～0.3 μg/kg，標準加標回收率為82.4%～108.5%。Yang等[12]利用攪拌棒吸附萃取方法，結合HPLC法檢測9種藥物的LOD均在0.1～0.3 μg/kg范圍內，回收率為67.4%～99.0%。Bozkurt等[13]利用HPLC-FLD法分析牛奶、雞蛋、雞肉、魚肉、牛肉樣品，回收率在70%～100%范圍內，LOD分別為：ENR 19.50×10-3μg/L，CIP 8.39×10-3μg/L，OFL 3.23×10-3μg/L。Vakh等[14]用HPLC-FLD法檢測嬰兒食品樣品，LOD、LOQ分別為，NFX、OFL均為1.5 μg/L、5 μg/L，回收率在86%～122%范圍內。Mei等[15]采用HPLC-DAD檢測技術，測得牛奶樣品LOD為0.10～0.216 μg/L，回收率為68.8%～120%。

不同樣品基質中FQs殘留HPLC、HPLC-FLD、HPLC-DAD、反相HPLC(RP-HPLC)檢測方法的比較如表2所示。其中反相HPLC是由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，正好與由極性固定相和弱極性流動相所組成的液相色譜體系(正相色譜)相反，幾乎可用于所有能溶于極性或弱極性溶劑中的有機物的分離。由表2可以看出，應用HPLC檢測法所得樣品的回收率、LOD、LOQ都很好，說明該檢測方法的準確度和靈敏度高。

表2 高效液相色譜法檢測不同樣品基質中氟喹諾酮類藥物殘留的比較Tab 2 Comparison of HPLC methods for detection of fluoroquinolones in different matrices

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表中“-”為沒有數據，上標“*”單位為μg/L，下同。

1.3 超高效液相色譜法 超高效液相色譜法(Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC)基于HPLC的理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、低系統體積及快速檢測手段等全新技術，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量。在儀器工藝方面，超高效液相色譜儀采用新型的色譜填料及裝填技術，配備了優秀的超高壓液相色譜泵、自動進樣器、高速檢測器，并優化了系統的綜合設計，使儀器分析能力大大增強。

Aufartová等[32]利用UPLC-FLD測定西班牙Gran Canaria Island魚類5種FQs，LOD介于0.1～6.0 μg/kg之間，在兩個加標濃度水平(25 μg/kg和250 μg/kg)下獲得的回收率均大于90%。Vardali等[33]以UPLC-DAD檢測鱸魚肌肉和皮膚組織中DAN，LOD為13.73 μg/kg，回收率為90.2%～101.2%。不同樣品基質FQs殘留比較結果如表3所示，由表中可知，應用UPLC檢測FQs殘留時多使用C18柱進行分離，因基質、檢測器、流動相等條件的不同，所得回收率、LOD、LOQ差別很大。所搭配的檢測器均為FLD，該檢測器因其選擇性、靈敏度高而被廣泛使用，但其只對熒光物質有響應，因而使用也有所受限。

表3 超高效液相色譜法檢測不同樣品基質中氟喹諾酮類藥物殘留的比較Tab 3 Comparison of UPLC methods for detection of fluoroquinolones in different matrices

2 液質聯用法

質譜分析是先將待測物離子化，按離子的質荷比分離，然后測量各種離子譜峰的強度而實現分析目的的分析方法。色譜質譜的聯用將色譜的分離能力與質譜的定性功能結合起來，實現對復雜混合物更準確的定量和定性分析，也簡化了樣品的前處理過程，使樣品分析更簡便。

利用液相色譜-質譜聯用法(Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)檢測FQs殘留是通過分析樣品經液相色譜分離后，進入離子源離子化，通過記錄FQs特征離子峰下的分離時間-信號強度譜圖，并計算色譜峰面積的方法從而達到定性和定量分析。由于液質聯用主要給出待測物的相對分子質量，碎片很少，缺乏結構信息，需要多級質譜技術。

Kantiani等[41]用LC-MS對生牛乳和脫脂牛乳中的15種FQs殘留同時定量和確證，LOD分別介于0.01～1.93 μg/L、0.03～4.23 μg/L。Tang等[42]應用固相微萃取(SPME)-LC-MS法快速測定養殖河豚魚肌肉中FQs殘留，LOD為0.3～1.5 μg/kg。Montesano等[43]憑借LC-MS/MS建立了一種快速檢測馬波沙星(FQs的一種)的方法，利用超濾法完成樣品前處理，該法僅需要175 μL的樣品便可完成檢測，LOD為1 μg/L。Johnston等[44]用LC-MS/MS同時分析了鮭魚、對蝦和鮑魚中8種FQs的殘留量，所有樣品均在12 min內出峰，LOD介于1～3 μg/kg。Barreto等[45]使用LC-MS/MS測定家禽、牛、豬和魚肌肉中9種FQs殘留，回收率介于79%～115%，LOD和LOQ分別為5 μg/kg和10 μg/kg。Chen等[46]開發新型多重單片纖維固相微萃取(APDE / MMF-SPME)與HPLC-MS/MS的組合檢測牛奶和蜂蜜樣品中FQs殘留量，LOD分別為：牛奶0.0019～0.018 μg/kg，蜂蜜0.0010～0.0028 μg/kg，回收率在74.5%～116%之間。SM Da等[47]以電場輔助基質固相分散體作為提高氟喹諾酮提取效率和凈化的有力工具，利用UPLC-MS/MS法測得牛奶中7種FQs殘留，LOQ為20 μg/L，回收率為80.5%～95.7%。Meng等[48]以UPLC-MS/MS法分析牛奶中8種FQs殘留，LOQ為0.01～0.29 μg/kg，回收率為61.0%～115.0%。

不同樣品基質FQs殘留比較結果如表4所示，由表中可知，流動相的選擇多用到甲酸，這是因為流動相中加入甲酸、乙酸等,可提高正離子化效率，但是否加酸需根據色譜的分離情況、樣品在酸性條件下的穩定性等決定。與液相色譜的常用檢測器相比，質譜作為檢測器使用，可提供相對分子質量和大量碎片結構信息，在提供保留時間以外，還能提供每個保留時間下所對應的質譜圖，相應增加了定性能力。

表4 液質聯用法檢測不同樣品基質中氟喹諾酮類藥物殘留的比較Tab 4 Comparison of LC-MS methods for detection of fluoroquinolones in different matrices

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3 展 望

當前，色譜和質譜檢測FQs殘留已經成為熱門。其中HPLC-FLD、UPLC-FLD是FQs殘留檢測最常用的方法，與HPLC-FLD相比，UPLC-FLD具有分析效率高、流動相消耗少、靈敏度更高等優點，適合批量樣品分析。兩種方法也有應用局限，FLD只對熒光物質有響應，且基質中可能含有一些內源性熒光物質，從而會對目標物分析造成干擾。

液質聯用法的應用已成為趨勢，雖然MS可提高檢測效率，但分析復雜樣品時，有著難以排除基質干擾和共流出化合物的問題，MS串聯可解決目標物的定性和定量問題，消除基質干擾，使檢測結果更為準確可靠。UPLC-MS涵蓋了極小顆粒填料、超低系統體積及超快速檢測等新技術，在全面提升HPLC-MS的速度、靈敏度及分離度等諸多重要品質的同時，具有卓越的分離性能和高通量的檢測水平，可以成為復雜體系分離分析以及化合物結構鑒定的良好平臺，在FQs殘留分析中具有獨特優勢。可以預測，HPLC、UPLC與質譜聯用將是FQs殘留檢測的研究熱點。