復(fù)方楓蓼顆粒制備工藝研究

高彪，蔣琪，向蓉，陳文露，徐志宏，彭新宇

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所 農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實驗站 廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室 廣東省中獸藥工程技術(shù)研究中心, 廣州 510640)

復(fù)方楓蓼是民間防治胃腸道疾病的經(jīng)典中藥復(fù)方。由牛耳楓和辣蓼兩味中藥按2∶1的比例組成[1]。牛耳楓(DaphniphyllumcalycinumBenth.)又稱牛耳鈴，是屬虎皮楠科(Daphniphyllaceae)虎皮楠屬植物，具有極高的藥用價值，果實及其枝葉均可入藥[2]。該藥具有活血散瘀、祛風(fēng)止痛、止痢清熱等功效，主治痢疾、風(fēng)濕骨痛、感冒發(fā)熱等疾病[3]。辣蓼(polygonumhydropiperL)又稱柳蓼，為蓼科(Polygonaceae)蓼屬(polygonum)植物[4]。全草可入藥，具有止痢、活血化瘀、止癢殺蟲等功效。主治腹瀉、腸胃炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛、跌打損傷等[5]。現(xiàn)代藥理研究表明，該復(fù)方中含有黃酮類、倍半萜類、生物堿類、有機(jī)酸類等化學(xué)成分[6-7]，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌、抗?jié)冃越Y(jié)腸炎、保護(hù)胃黏膜等多方面的藥理作用，臨床用其治療急性胃腸炎、食滯胃痛等癥，具有良好效果[8-9]。

牛耳楓、辣蓼臨床用于預(yù)防及治療胃腸道時，多為湯劑。但是湯劑煎煮程序麻煩、口服量大、口味不佳，且攜帶、貯存不變，與現(xiàn)代生活不相符合。而顆粒劑作為一種固體制劑，攜帶、貯藏及服用均方便，且藥物穩(wěn)定性及生物利用度高。研究通過單因素和正交實驗確定了最佳提取工藝。在此基礎(chǔ)上采用濕法制粒，考察顆粒劑的制備方法，以吸濕率、粒度合格率及溶化性、外觀為考察指標(biāo)篩選出楓蓼顆粒劑的制備工藝，并進(jìn)行半成品的質(zhì)量控制。旨在研究出質(zhì)量穩(wěn)定，服用方便的復(fù)方楓蓼顆粒。

1 材料與方法

1.1 材料 高效液相色譜儀，美國Waters公司；RE-5399型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；UV-3100PC型紫外分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司；SB25-12DT型超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；Metter-Toledo-xs型十萬分之一天平，瑞士梅特勒公司；SHZD-D(Ⅲ)型循環(huán)式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；804R型低溫離心機(jī)，上海艾本德生物技術(shù)有限公司；DZF-6050型真空干燥箱，上海申賢恒溫設(shè)備廠；HWS-158型恒溫恒濕箱，寧波江南儀器廠；101-2型電熱鼓風(fēng)干燥器，上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠。

牛耳楓藥材購于廣東茂名(批次201507)；辣蓼藥材購于廣東茂名(批次201508)；經(jīng)廣東藥學(xué)院李書淵教授鑒定為蓼科植物水辣蓼PolygonumhydropiperLinn.和虎皮楠科植物牛耳楓DaphniphyllumcalycinumBench.。藥材經(jīng)低溫干燥后，粉碎，過20目篩，按牛耳楓辣蓼2∶1的比例混合均勻，備用。

蘆丁，批號100080-201409，中國食品藥品檢定研究院，純度≥98%；槲皮素，批號10081-201509，中國食品藥品檢定研究院，純度≥98%；乙腈，色譜純；超純水，自制；糊精；蔗糖；可溶性淀粉及實驗中所用的其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 提取液的配制 取楓蓼藥粉(牛耳楓∶辣蓼=2∶1)20g，精密稱定，置于500 mL圓底燒瓶中，按不同的提取工藝對藥物進(jìn)行回流提取，過濾，減壓濃縮，溶劑定容至100 mL。

1.2.2 總黃酮含量的測定[16]精密吸取提取液1 mL，加30%乙醇至6 mL，加5%NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加10%Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加4.3%NaOH溶液10 mL，再加30%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，放置15 min后，以相應(yīng)試劑為空白對照，于510 nm處依照UV法測定吸光度，通過總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算總黃酮含量。

1.2.3 槲皮素含量的測定[17]色譜條件：Waters Symmetry shield RP18 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)；流動相：A為乙腈，B為0.4%磷酸水溶液；梯度洗脫：0～13 min,A為20%～45%；13～15 min，A為45%～60%；15～20 min,A為70%～20%；流速：1 mL/min；檢測波長：370 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量10 μL，理論塔板數(shù)按槲皮素峰計算應(yīng)不低于3000。測定槲皮素峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算槲皮素含量。

1.2.4 出膏率的測定 精密量取定容后的楓蓼藥液50 mL，置于已經(jīng)干燥至恒定重量的蒸發(fā)皿中，將其水浴蒸干后，105 ℃恒溫干燥3 h后，置于干燥器中放冷0.5 h后，迅速稱重，計算出膏率。

1.2.5 提取工藝優(yōu)化

1.2.5.1 提取溶劑的考察 水提取法：取楓蓼藥粉20 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加水200 mL，浸泡1 h，加熱回流1 h，減壓濃縮至100 mL，過濾，即得，測定槲皮素、總黃酮含量及出膏率。

乙醇提取法：取楓蓼藥粉20 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，分別加45%、65%、85%的乙醇200 mL、浸泡1 h，減壓濃縮至100 mL，過濾，即得，測定槲皮素、總黃酮含量及出膏率。

1.2.5.2 正交試驗 在提取溶劑考察的基礎(chǔ)上，選擇料液比、乙醇濃度、提取時間及提取次數(shù)為影響提取效率的主要因素，設(shè)計三個水平，采用正交試驗，見表1，以總黃酮、槲皮素的含量及出膏率為考察指標(biāo)，進(jìn)行綜合評分，優(yōu)選楓蓼藥材最佳提取工藝。

1.2.6 濃縮干燥工藝的研究

1.2.6.1 濃縮工藝 減壓濃縮具有濃縮效率高，溫度低、有效成分損失少等特點。故本節(jié)對濃縮溫度進(jìn)行考察。按最佳提取工藝平行提取9次，制備9份提取液，6000 r/min離心10 min后，分別在0.08 mpa下以50 ℃、60 ℃、70 ℃濃縮至相對密度為1.15～1.25的浸膏，測定總黃酮平均含量。考察最佳濃縮工藝。

1.2.6.2 減壓干燥工藝 溫度是影響干燥效率的主要因素。故本節(jié)采用單因素變量法重點討論溫度的影響。將相對密度為1.15～1.25的浸膏分成9份，每份100 g，于60 ℃、70 ℃、80 ℃下真空干燥，以總黃酮含量為指標(biāo)，考察最佳減壓工藝。

1.2.7 成型工藝

1.2.7.1 輔料的選擇 以制粒難易程度，外觀、硬度等作為指標(biāo)，篩選糊精、蔗糖、可溶性淀粉等輔料，找出最佳比例，確定濕法制粒最佳工藝條件。

1.2.7.2 濕法制粒 預(yù)實驗表明影響制粒的因素主要包括：干燥溫度、乙醇濃度、輔料用量及輔料與藥粉的比例。故采用四因素三水平L9 (34)正交表(表2)安排正交試驗，以吸濕率、粒度合格率、外觀溶化性為考察指標(biāo)進(jìn)行處方篩選。

取已制備好的干膏粉30 g，以14目篩制顆粒，干燥后取出放冷至室溫，14目篩整粒，即得。

吸濕率 精密稱定楓蓼顆粒2 g，置于干燥至恒定重量的稱量瓶底部，將稱量瓶放置在相對濕度為75%干燥器內(nèi)(瓶蓋已打開)25℃放置48 h后稱定顆粒重量。按公式(2)計算吸濕率。

吸濕率=(吸濕后顆粒重量—吸濕前顆粒重量)/吸濕前顆粒劑重量 ×100%(2)

粒度合格率 按照2010年版《中國藥典》一部附錄XIB法，取顆粒50 g于一號篩中，下面放置五號篩。水平往返輕叩3 min，取合格顆粒稱重并按公式(3)計算粒度合格率。

粒度合格率(%)=合格的顆粒重量/過篩前重量×100%(3)

外觀溶化性 外觀根據(jù)顆粒硬度、均勻度及色澤進(jìn)行判斷；溶化性按照2010年版《中國藥典》一部附錄ⅠC項下溶化性檢查法進(jìn)行考察。二者共同采用十分制進(jìn)行打分。

1.2.5.3 提取工藝驗證試驗 取楓蓼藥粉3份，每份10 g，按照最佳提取工藝，以10倍量65%的乙醇回流提取2次，每次60 min，收集合并提取液，過濾，測定總黃酮含量、槲皮素含量及出膏率，計算RSD，對最佳提取工藝進(jìn)行驗證。

表2 制劑成型工藝因素水平表Tab 2 Factors of level of orthogonal test

1.2.7.3 制備工藝驗證試驗 按優(yōu)選出的最佳工藝進(jìn)行重復(fù)性試驗驗證。

1.2.8 半成品質(zhì)量控制 為了保證成品顆粒制劑的穩(wěn)定性及一致性，在制劑的制備過程中需要對顆粒劑半成品進(jìn)行質(zhì)量控制，故本研究考察了溶化性、休止角及臨界相對濕度。

1.2.8.1 溶化性 照2010年版《中國藥典》一部附錄ⅠC項下溶化性檢查法進(jìn)行考察。5 min內(nèi)，三批樣品全部溶解，達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.8.2 休止角 休止角是考察粉體或顆粒流動性的指標(biāo)，通常采用漏斗法測定其角度。將漏斗置繪圖紙上方一定的距離H，把制備好的顆粒從漏斗中倒入，直至顆粒形成的圓錐頂端與漏斗的出口處接觸，圓錐體的直徑為2R，錐體高度H，根據(jù)公式tanα=H/R即可求出休止角α，α越小流動性越好。

1.2.8.3 臨界相對濕度 為了確定環(huán)境濕度對顆粒制劑生產(chǎn)及貯存的影響，故本節(jié)需對顆粒的臨界相對濕度作出考察。

取干燥至恒重的成品顆粒2 g，平行取三份，放入相對濕度為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的環(huán)境中，25℃下放置96 h后取出，測定吸濕前后顆粒重量變化。

吸濕率=(吸濕后顆粒重量—吸濕前顆粒重量)/吸濕前顆粒重量×100% (4)

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS20. 0 統(tǒng)計軟件對所得所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，正交試驗結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的考察結(jié)果 分別考察了水回流提取以及45%、65%、85%乙醇提取的提取效率，結(jié)果見表3。以乙醇為提取溶劑時的提取效率優(yōu)于以水為提取溶劑時的提取效率。故選擇乙醇作為提取溶劑。

表3 不同提取溶劑試驗結(jié)果Tab 3 Different extraction solvent tests

2.2 方差分析結(jié)果 由正交試驗和方差分析結(jié)果(表4和表5)可知，A、B因素對提取效果具有顯著性意義(P<0.05)，C因素差異不顯著，極差A(yù)>B>C>D，故對實驗結(jié)果影響主次順序為A(乙醇濃度)>B(提取次數(shù))>C(提取時間)>D(加醇量)，A因素中A2>A3>A1，B因素中B2>B3>B1，C、D為次要因素，故從節(jié)約時間原則上確定最優(yōu)綜合評分方案為A2B2C1D2。綜合以上分析，確定本次試驗最佳工藝為：10倍量65%的乙醇回流提取2次，每次60 min。

表4 正交試驗結(jié)果表Tab 4 The results of the orthogonal

續(xù)表

X=(X1/X1mas)×40+(X2/X2mas)×40+(X3/X3mas)×20

表5 醇提取結(jié)果方差分析表Tab 5 Ethanol extraction of variance results

F0.05(2,2)=19

2.3 提取工藝驗證結(jié)果 由表6可知，總黃酮RSD為0.88%、槲皮素RSD為0.14%，出膏率RSD為1.85%，說明該法重復(fù)性好。

表6 提取工藝驗證結(jié)果表Tab 6 Confirming test of the technology

2.4 濃縮干燥工藝結(jié)果

2.4.1 濃縮工藝結(jié)果 將相對密度為1.15～1.25的浸膏分成9份，每份100 g，于60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃下真空干燥，計算干燥后總黃酮含量，由表7可知50 ℃時總黃酮含量最高，70 ℃時總黃酮含量最低，50 ℃和60 ℃含量差別不大，而70 ℃和60 ℃含量差別相對較大，因溫度越高，濃縮時間越短，故選擇濃縮溫度為60 ℃減壓濃縮。

表7 濃縮試驗結(jié)果表Tab 7 The results of concentrate test

2.4.2 減壓干燥工藝結(jié)果 由表8可知70 ℃總黃酮含量最高，80 ℃時次之，90 ℃最低，可能原因是60 ℃干燥時間過久，90 ℃溫度過高導(dǎo)致成分損失。80 ℃相比之下干燥時間斷，成分損失相對較少，故選擇干燥溫度為80 ℃。

表8 減壓干燥試驗結(jié)果表Tab 8 The results of decompression drying

2.5 成型工藝

2.5.1 輔料的選擇結(jié)果 對于顆粒劑來說，目前常用的賦形劑包括乳糖、可溶性淀粉、蔗糖、糊精等。常用的潤濕劑包括水和不同濃度的乙醇。預(yù)實驗中考察了糊精、可溶性淀粉、蔗糖的吸水性。由圖1知，糊精與蔗糖吸濕性較低。糊精具有價格低廉，且易溶于水，成型性好等特點，蔗糖用于藥用輔料時具有矯味及粘合的作用。綜合制粒效果及成本方面的考慮，故決定采用糊精及蔗糖組成混合的輔料。

2.5.2 濕法制粒 以干燥溫度，乙醇濃度，輔料用量及輔料與藥粉的比例為考察因素，選擇三個水平，以吸濕率、粒度合格率，外觀溶化性作為考察指標(biāo)進(jìn)行處方篩選，根據(jù)正交試驗結(jié)果表(表9)及方差分析表(表10-表12)可知，在吸濕率測定中，C因素對試驗結(jié)果具有顯著性影響，A、B因素影響不顯著，極差C>B>A>D，故影響吸濕率的主次順序是C(酒精濃度)>B(糊精：蔗糖)>A(藥物：輔料)>D(溫度)，C因素中C2>C1>C3，最優(yōu)組合為處A3B1C2D1 。 在粒度合格率測定中，A因素對試驗結(jié)果具有顯著性影響，B、C因素影響不顯著，極差A(yù)>B>C>D，故影響吸濕率的主次順序是A(藥物：輔料)>B(糊精：蔗糖)>C(酒精濃度)>D(溫度)，A因素中C2>C1>C3，最優(yōu)組合為處A2B2C2D1。 在溶化性、外觀測定中，A、B、C、D各因素差異均不顯著，所以根據(jù)極差A(yù)>C>B=D，最優(yōu)組合為A2B3C1D1。由表13綜合分析可知，優(yōu)選工藝為A2B1C2D1。即85%乙醇作潤濕劑，藥物與輔料比例為1∶1.5，糊精與蔗糖比例為3∶2，干燥溫度為60 ℃。

圖1 輔料吸濕性考察Fig 1 Hygroscopicity test

表9 制劑成型工藝正交試驗結(jié)果表Tab 9 Results of orthogonal test

續(xù)表

表10 吸濕率方差分析表Tab 10 Hygroscopicity of variance results

F0.05(2,2)=19

表11 粒度合格率方差分析表Tab 11 Granule pass rate of variance results

F0.05(2,2)=19

表12 溶化性、外觀方差分析表Tab 12 Solubility and exterior of variance results

F0.05(2,2)=19

表13 工藝優(yōu)化綜合分析表Tab 13 The results of process optimization

2.5.3 制備工藝驗證試驗 由表14可知，吸濕率RSD為1.72%，粒度合格率RSD為90.99%，溶化性、外觀RSD為0%，制備工藝重復(fù)性好。

2.6 半成品質(zhì)量控制結(jié)果

2.6.1 溶化性 照2010版本《中國藥典》一部附錄ⅠC項下溶化性檢查法進(jìn)行考察。5 min內(nèi)，三批樣品全部溶解，達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)。

2.6.2 休止角 為錐體直徑為2R，錐體高度為H，tanα=H/R，計算α。由表13可知：平均休止角為34.2°<40°，表明顆粒流動性較好。

表14 驗證試驗結(jié)果表Tab 14 Verification of moulding technology

表15 止角試驗結(jié)果表Tab 15 Angle of repose granule

2.6.3 臨界相對濕度 不同濕度條件下顆粒平均吸濕率見表16。以環(huán)境相對濕度RH%為橫坐標(biāo)，平均吸濕率(%)為縱坐標(biāo)作圖。 由圖2知，臨界相對濕度在67%以上時，吸濕率明顯加大。因此在制粒、包裝、貯藏時，外界濕度應(yīng)控制在67%以下。

表16 顆粒吸濕平衡試驗結(jié)果表Tab 16 Moisture absorption rate of granule

圖2 不同相對濕度下浸膏粉的吸收率Fig 2 Hygroscopic rates in different RH

3 討論與結(jié)論

中藥顆粒劑是指中藥材經(jīng)過不同溶劑的提取，再與適宜的輔料或不封藥材細(xì)粉以一定比例混勻，制成的感顆粒狀劑型。顆粒劑的制備過程通常包括藥材提取純化、濃縮、干燥以及成型等工藝流程。是一種便于攜帶和服用的療效顯著提高的新劑型，具有易溶解、易吸收，生物利用度高、服用方便等特點[11]。

提取工藝是制劑過程中最重要的環(huán)節(jié)之一，對中藥制劑的處方篩選及藥物療效起著根本性作用，傳統(tǒng)提取方法提取效率低，目前中藥復(fù)方提取工藝優(yōu)化主要有正交設(shè)計、均勻設(shè)計及響應(yīng)面設(shè)計等方法，安排多因素、多水平試驗，設(shè)計合理試驗方案[12-13]。本研究先采用單因素變量法考察提取溶媒的種類，再運用正交實驗法以總黃酮含量、槲皮素含量以及出膏率為指標(biāo)進(jìn)行綜合評價，篩選出最佳提取工藝為10倍量65%的乙醇回流提取2次，每次60 min。優(yōu)選工藝穩(wěn)定、可靠。蘇春梅等[15]研究益母草顆粒的制備工藝時，采用正交試驗優(yōu)選出了最佳提取工藝。喬鵬等[16]在研究瓦松顆粒劑制備工藝時，也采用了乙醇連續(xù)回流提取法提取黃酮類有效成分。中藥提取后，要進(jìn)行濃縮成浸膏，是關(guān)系到制粒工藝的關(guān)鍵技術(shù)之一，浸膏相對密度越大，制粒時輔料加入量越少，服用劑量越少。通常采用簡易的真空濃縮。該方法具有高效且有效成分損失小的特點。單因素變量法考察了濃縮溫度對總黃酮含量的影響，確定最佳濃縮溫度為60℃。干燥工藝采用真空減壓干燥工藝，該法具有干燥時間短及干燥溫度低等特點，能有效降低有效成分的。單因素變量法考察了干燥溫度對總黃酮含量的影響，結(jié)果表明，80℃下干燥效率最高。

輔料是制備制劑時必要的物質(zhì)，顆粒劑常用的輔料有乳糖、糊精、蔗糖。許玲玲等[17]在研究杉斛顆粒劑制備工藝時，考察了不同的輔料對顆粒劑的影響，發(fā)現(xiàn)淀粉和糊精(1∶1)混合制成的顆粒劑合格率最高。楓蓼顆粒劑的成型工藝輔料篩選中，考慮到成本因素及顆粒的成型性等因素，本研究選用了糊精和蔗糖。采用正交因素試驗進(jìn)行處方篩選出最佳成型工藝為85%乙醇作潤濕劑，藥物與輔料比例為1∶1.5，糊精與蔗糖比例為3∶2制軟材，過14目篩，干燥溫度為60 ℃，14目篩整粒即得。中間體質(zhì)量控制考察了顆粒的溶化性、休止角及臨界相對濕度。休止角測量法為評價顆粒流動性的常用且簡便的方法，此法精確度不高，容易形成誤差，因此要做平行試驗3次，且注入物料是要盡量使其與標(biāo)準(zhǔn)圓錐形狀接近，以減少試驗誤差。王秀麗等[18]在研究慈姑多糖部位顆粒劑制備工藝時，休止角測量3次，平均值為39°，流動性符合要求。本次結(jié)果顯示顆粒全部溶解，休止角平均數(shù)為34.2°，流動性良好，臨界相對濕度為67%。