獸用二氨基嘧啶類抗菌增效劑毒理學研究進展

郭京超，孫亞奇，劉振利，王旭，袁宗輝

(國家獸藥殘留基準實驗室(華中農業大學)；農業部獸藥殘留檢測重點實驗室；農業部畜禽產品質量安全風險評估實驗室(武漢)；華中農業大學動物醫學院,武漢 430070)

獸用抗菌增效劑是一類與某些抗菌藥物配伍使用，以特定的機制增強其抗菌活性的藥物。獸用抗菌增效劑本身具有一定的抗菌活性，當其與抗生素合理配伍使用時，能夠通過抑制酶的作用等不同機制提高血藥濃度，降低抗生素的毒副反應，減少細菌耐藥性，增強抗菌作用，提高治療效應，對治療疾病起到事半功倍的效果[1]。目前，獸用抗菌增效劑應用于臨床的有甲氧芐啶、二甲氧芐啶、巴喹普林和奧美普林，其中甲氧芐啶作為最早上市的品種，在臨床上已產生廣泛的耐藥性，并且受限于較短的半衰期和較低的生物利用度，所以，在獸醫臨床中的應用十分有限。近年來，隨著新型獸用抗菌增效劑巴喹普林和奧美普林的相繼上市，它們作為動物專用藥，進一步擴展了磺胺類在畜牧業的使用范圍。巴喹普林與磺胺類藥物組合的復方制劑Zaquilan(BQP與SM2以1∶5制成)已用于豬、牛和犬等動物，奧美普林和磺胺類的復方制劑則用于家禽和水產養殖方面[2]。

二氨基嘧啶類獸用抗菌增效劑能夠通過不同的抗菌作用機理，影響到細菌生長的不同環節，使抗生素的抗菌譜擴大，增強抗菌活性[3]。盡管抗菌增效劑和抗菌藥物配伍使用效果優良，但是我們也不能忽略它潛在的安全性問題。在早期的藥物研發和使用過程中，由于藥物注冊法規不完善或者受限于當時的技術手段等因素，對臨床前的毒理學研究未作系統明確的要求，藥物的安全性評價未能得到足夠的重視。然而，隨著在世界范圍內對于各種新藥的研發，除了保證藥效之外，需要更加注重藥物的安全性問題。本文以二氨基嘧啶類藥物為例對獸用抗菌增效劑的毒理學研究作簡單介紹，以期給此類藥物的合理使用和新藥研發提供參考，其化學結構式如圖1所示。

圖1 二氨基嘧啶類藥物化學結構Fig 1 Chemical structure of diaminopyrimidines

1 二氨基嘧啶類藥物的毒理學研究

1.1 甲氧芐啶的一般毒性及特殊毒性 甲氧芐啶在小鼠的急性經口毒性試驗表明，其半數致死量(LD50)大于2000 mg/kg b.w.，并且甲氧芐啶與等劑量磺胺藥物同時作用不受影響[4]。歐洲藥品管理局提供的報告顯示，甲氧芐啶在小鼠急性經口毒性試驗的LD50值為1500～1850 mg/kg b.w.，在大鼠的LD50值為1910～3960 mg/kg b.w.，表明其屬于低毒物質。在甲氧芐啶的慢性毒性試驗中，其對大鼠的主要不良影響是引起造血系統的抑制和發育缺陷，主要表現為血紅蛋白濃度下降，以及紅細胞，中性粒細胞，淋巴細胞和血小板數量的減少。此外，還有報道甲氧芐啶能夠引起比格犬甲狀腺和腦垂體的組織學變化，白細胞減少以及血清膽固醇濃度升高[5]。

通過對不同物種的個體、胎兒、細胞進行甲氧芐啶的遺傳毒理學研究，發現不同物種的個體、胎兒、細胞的遺傳毒性試驗結果各不相同。綜合這些結果，表明甲氧芐啶的遺傳毒性具有種屬差異(表1)。

表1 甲氧芐啶的遺傳毒性Tab 1 The genotoxicity of trimethoprim

1.2 二甲氧芐啶的一般毒性及特殊毒性 小鼠急性口服的LD50>5000 mg/kg b.w.，一次口服最大耐受量為30000 mg/kg b.w.，而二甲氧芐啶與磺胺類藥物合劑的LD50超過4000 mg/kg，二甲氧芐啶在Wistar大鼠的急性經口毒性試驗表明，其LD50值為2330 mg/kg b.w.[11-13]。二甲氧芐啶的90 d喂養試驗中，二甲氧芐啶的給藥濃度分別為23、230、1150、2000 mg/kg b.w.。其結果顯示，高劑量組大鼠血清ALP和K+出現病理學意義的升高，組織病理學檢查大鼠腎臟皮質和髓質部分出現異常病變，腎上腺皮質部分出現水泡樣病變。因此，二甲氧芐啶對Wistar大鼠亞慢性毒性作用的靶器官為腎臟[14]。在猴和犬身上進行毒性試驗表明，在長期持續使用20倍于人的治療量時會出現造血機能紊亂，但在供給四氫葉酸以后即恢復。連續九周對大鼠給藥的亞急性毒性試驗表明，除造血功能受影響外，對其他系統均未有明顯毒性。給藥期間，不影響受試動物的采食、產卵和增重[10]。

Yoshimura 選用鼠傷寒沙門氏菌TA100和TA98來研究二甲氧芐啶的遺傳毒性。在加與不加大鼠肝S9的情況下，二甲氧芐啶對鼠傷寒沙門氏菌TA100和TA98均沒有明顯地致突變作用，但是在加入中國倉鼠肝S9的條件下，二甲氧芐啶對菌株TA100具有致突變作用[15]。Ono等研究了二甲氧芐啶的遺傳毒性，進行的試驗包括umu試驗，細菌回復突變試驗，體外細胞染色體畸變試驗，嚙齒動物體內骨髓微核試驗以及彗星試驗。結果顯示二甲氧芐啶在umu試驗和細菌回復突變試驗中均顯示陰性，在沒有體外代謝活化系統中，可導致培養的中國倉鼠CHL細胞染色體結構畸變，但在肝S9存在的情況下，沒有致畸作用，可能是由于肝臟的解毒功能。分別在大鼠和小鼠進行的二甲氧芐啶骨髓微核試驗中，單劑量和三倍劑量均顯示陰性。彗星試驗表明，單一口服二甲氧芐啶會嚴重損害肝、腎、肺和脾細胞DNA，而在骨髓細胞則未出現[6]。因此，二甲氧芐啶對哺乳動物細胞有遺傳毒性(表2)。

表2 二甲氧芐啶的遺傳毒性Tab 2 The genotoxicity of diaveridine

Ono-Ogata等研究了幾種抗原蟲藥物在加和不加亞硝酸鹽的情況下，對大腸桿菌WP2uvrA/pKM101和鼠傷寒沙門氏菌TA100和TA98的致突變作用，其中二甲氧芐啶在不同試驗條件下對各菌株均沒有致突變活性[18]。

Wang等利用Wistar大鼠二代繁殖試驗以及喂養致畸試驗，以評價二甲氧芐啶的生殖發育毒性。在二代繁殖試驗中，二甲氧芐啶對Wistar大鼠生殖發育毒性的最大無作用劑量(NOAEL)為23 mg/kg b.w.。在喂養致畸試驗中，各劑量組未出現與藥物相關的畸形，NOAEL為23 mg/kg b.w.[19]。

1.3 巴喹普林的一般毒性及特殊毒性 巴喹普林的急性經口毒性試驗中LD50約為500～1000 mg/kg b.w.，屬于低毒物質。巴喹普林的毒性效應主要是造成中樞神經系統和肝臟的損傷[20]。

巴喹普林重復劑量毒性試驗中，大鼠6～10 d(0,6.25,25和100 mg/kg b.w.)，21 d (0,5,20和80 mg/kg b.w.)，90 d (0,4,16和64 mg/kg b.w.)和犬的6個月(0,2, 5,8和12.5 mg/kg b.w.)等毒性試驗結果表明其有一定的肝臟毒性，主要表現為肝細胞中有鐵血黃素沉積以及出現炎癥和壞死。此外，巴喹普林還對血清酶(如堿性磷脂酶)和其他血液生化參數(如膽固醇，總蛋白和白蛋白)造成影響。在犬的6個月慢性毒性試驗中，最低給藥濃度2 mg/kg b.w.的情況下，犬僅出現輕微的肝細胞變性，臨床觀察出現輕微異常，其在犬上的NOAEL為2 mg/kg b.w.。在大鼠的90 d喂養試驗中，最低給藥濃度4 mg/kg b.w.的情況下，大鼠出現了很輕微但呈劑量效應關系的臨床化學指標變化，其在大鼠上的NOAEL為4 mg/kg b.w.[20]。

在巴喹普林的遺傳毒性研究中，進行的試驗包括體內試驗和體外試驗。其中體外試驗有細菌回復突變試驗、細菌彷徨變異試驗、體外CHO-hgprt基因突變試驗和淋巴細胞染色體畸變試驗，體內試驗為小鼠微核試驗和小鼠顯性致死試驗。以上各試驗項目的結果均為陰性(表3)，通過上述結果說明巴喹普林不具有致突變性[20]。

在兔的兩代繁殖試驗研究中，巴喹普林30 mg/kg b.w.劑量組使幼兔的腭裂發生率增加。同樣，這一效應在另一研究中的45 mg/kg b.w.劑量組也出現。12和30 mg/kg b.w.劑量組產仔數和仔重下降，2 mg/kg b.w.劑量組孕鼠體重和飼料利用率也均出現下降，巴喹普林在兔的NOAEL為2 mg/kg b.w.[20]。

在大鼠和兔的致畸試驗研究中，未發現巴喹普林的致畸效應，且巴喹普林在兔的兩代繁殖試驗中30 mg/kg b.w.劑量出現的胎兒毒性是由母體毒性引起的。因此，致畸試驗中將致畸作用的NOAEL定為12 mg/kg b.w.，而生殖毒性的NOAEL定為5 mg/kg b.w.[20]。

表3 巴喹普林的遺傳毒性 Tab 3 The genotoxicity of baquiloprim

+/-，加和不加代謝活化系統；n/a，研究中沒有使用代謝活化系統

1.4 奧美普林的毒理學研究 Roche公司研發的增效磺胺 ROFENAID-40是以奧美普林(OMP)與磺胺二甲氧嘧啶(SDM)按 3∶5的比例做成的0.02%預混劑[21]。在一份研究報告中報道了其對雞、火雞、小鼠、大鼠和兔的急性經口毒性試驗，結果以LD50表示(表4)[22]。可以看出奧美普林的毒性較小，且以復合制劑用于臨床時，安全性進一步提高[23]。

在13周亞慢性毒性研究中，大鼠在最高劑量100 mg SDM+ 60 mg OMP/kg b.w.的情況下，體重增長出現輕微抑制，其它各組均未出現與藥物相關的毒性作用。在犬上的研究表明每日犬口服耐受劑量為75 mg/kg SDM + 45 mg/kg OMP或者單劑量45 mg/kg OMP[16]。

總之，以上試驗數據表明，無論奧美普林(OMP)或磺胺二甲氧嘧啶(SDM)單獨使用或聯合使用，均無明顯毒性，這是因為增效磺胺ROFENAID-40中兩者的濃度遠低于出現毒性效應的濃度[16]。

表4 ROFENAID-40在幾種動物的急性經口毒性結果Tab 4 The result for oral acute toxicity of ormetoprim in several animals

1.5 艾地普林的一般毒性及特殊毒性 在艾地普林急性經口毒性研究中，得到大鼠的LD50值為1402 mg/kg b.w.，小鼠的LD50值為1130 mg/kg b.w.，中毒的癥狀表現為震顫、驚厥、癲癇以及共濟失調[24]。Wolfe等進行了艾地普林在犬的亞慢性毒性試驗研究，最終確定NOAEL為1 mg/kg b. w.[25]。

通過對艾地普林進行的急性毒性試驗，得出了艾地普林對Wistar大鼠的急性毒性LD50值為1400 mg/kg b.w.[26]。90 d喂養試驗確定艾地普林亞慢性毒性試驗的NOAEL為1.44 mg/kg b.w.，未發現艾地普林對大鼠造血系統造成不良影響，這與艾地普林在比格犬引起的造血系統毒性以及同類藥物對犬和猴的造血系統毒性有所不同，推測艾地普林在不同種屬動物中存在代謝差異，從而引起毒性性質的不同[25]。

在大鼠兩代喂養繁殖與致畸試驗中，艾地普林在1000 mg/kg b.w.時對大鼠胚胎發育有抑制作用，對大鼠的生長發育和生殖機能有抑制作用，具有一定程度的繁殖和發育毒性，但無明顯的致畸性。艾地普林兩代喂養繁殖與致畸試驗的NOAEL分別為7.89、8.75 mg/kg b.w.[19]。

艾地普林遺傳毒性的研究中，在加和不加體外代謝活化系統的條件下進行以下試驗：體外CHO-hgprt基因突變試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗、體外V79細胞染色體畸變試驗、鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗和小鼠睪丸染色體畸變試驗，其結果均為陰性(表5)。綜合各項試驗的結果，確定艾地普林不具有致突變作用[19]。

表5 艾地普林的遺傳毒性Tab 5 The genotoxicity of aditoprim

+/-，加和不加代謝活化系統

2 展 望

參照WHO外來化合物的急性毒性劃分標準，大、小鼠一次經口的LD50(mg/kg)小于1時，極毒；1～50，劇毒；51～500，中等毒；500～5000，低毒。參照該標準，二氨基嘧啶類獸用抗菌增效劑均為低毒物質。

抗菌增效劑能抑制二氫葉酸還原酶，使二氫葉酸不能還原成四氫葉酸，阻斷細菌的葉酸代謝。目前發現這類藥物在一定劑量下能夠造成造血系統、肝臟、腦垂體及腎臟的損傷，但其損傷機制尚不清楚，有必要開展研究。獸用抗菌增效劑中除甲氧芐啶外，二甲氧芐啶、巴喹普林、艾地普林的生殖毒性NOAEL的范圍均在7～23 mg/kg b.w.內，其對生殖系統的安全性較低，但是在推薦劑量下并無明顯的生殖毒性。由于此類藥物在臨床實踐中可能存在超量使用，因此該類藥物的生殖毒性也是值得關注的。此外，藥物的毒性與其結構密切相關。研究表明，甲氧芐啶、二甲氧芐啶有遺傳毒性，而艾地普林、巴喹普林未發現具有遺傳毒性。在結構上這類藥物苯環四位及五位碳上甲氧芐啶、二甲氧芐啶各有一個有甲氧基，而奧美普林、艾地普林在苯環四位碳、五位碳上分別有一個甲氧基，巴喹普林的側鏈為喹啉基團。因此，甲氧芐啶和二甲氧芐啶的遺傳毒性可能與苯環四位及五位碳上同時具有甲氧基有關，但該推測尚需進一步證實。若四位及五位碳上甲氧基與二氨基嘧啶類抗菌增效劑遺傳毒性密切相關，則在今后同類藥物的開發過程中，將可能避免其遺傳毒性的產生，從而節約開發成本及時間。

二氨基嘧啶類抗菌增效劑通常與抗菌藥物配伍使用，在臨床的聯合用藥過程中，該類增效劑與抗菌藥物在體內的代謝和毒性效應值得關注。在藥物的聯合作用中，因代謝途徑的差異及代謝酶的不同，藥物之間可能產生不同效應，如協同，相加和拮抗作用等。而且，不同劑型的藥物之間藥理效應也存在明顯差異。由于細菌耐藥性問題，該類抗菌增效劑與多種抗菌藥應用的過程中，隨用藥量的增加，可能對機體產生毒性效應。因此，有必要開展該類抗菌增效劑與其它獸藥聯合用藥過程中的毒性效應研究，為抗菌藥的聯合應用提供依據。

化合物的毒性與其在體內的代謝密切相關。目前，在大鼠及小鼠上開展了二氨基嘧啶類抗菌增效劑的代謝及毒性研究，但是，隨著該類抗菌增效劑在臨床上廣泛用于多種動物的抗菌治療，如青蒿素與二甲氧芐啶或三甲氧芐啶聯合應用抗雞球蟲病等，表明有必要開展該類藥物在雞、豬等動物體內的代謝、毒性等的研究，為臨床合理用藥提供科學依據。

已有的二氨基嘧啶類獸用抗菌增效劑具有較高的臨床安全性，與抗菌藥物配伍廣泛應用于獸醫臨床，其在和磺胺類等抗菌藥物的應用過程中，能夠有效地降低抗菌藥物的毒副作用，提高療效。相信隨著對抗菌增效劑的深入研究，不但能為該類藥物的臨床用藥提供科學依據，還能為開發出高效、安全的抗菌增效劑奠定基礎。