TLR4/Myd88/NF-κ B通路介導表沒食子兒茶素沒食子酸酯對膿毒血癥大鼠急性腎損傷的保護作用

李木子，陳克研，孫倩，邱雨華

（1. 遼寧省金秋醫院腎內科，沈陽 110016； 2. 中國醫科大學實驗動物部，沈陽 110122）

急性腎損傷 （acute kidney injury，AKI） 是臨床上多種原因導致的危急重癥，19%～31%的患者因為腎功能不能完全恢復導致腎衰竭，死亡率高［1］。 膿毒血癥是AKI最常見的原因［2］。研究［3-4］表明，膿毒血癥誘導的AKI致病機制與其他病因引發的AKI不同。在膿毒血癥人群中，不依賴于AKI的嚴重程度，存在3種病理學改變：微循環功能障礙、炎癥和對損傷的生物能適應性反應［5-7］。細胞表面TLR4識別內毒素及其下游反應在脂多糖 （lipopolysaccharide，LPS） 導致的AKI病理生理中起著重要作用［8］。沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯 （epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶提取物的主要兒茶素，是強效的抗氧化劑和活性氧清除劑［9］。研究［10］表明，EGCG在AKI模型中具有潛在的作用。然而，EGCG對AKI的影響和分子生物機制尚未闡明，故本研究擬通過建立LPS誘導大鼠AKI模型，探討EGCG對AKI大鼠的保護作用及分子生物學機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：TLR4、Myd88、核因子kappa B （nuclear factor-kappa B，NF-κ B）抗體 （美國CST公司）；LPS來源于大腸桿菌O55；BS （英國Sigma-Aldrich公司）；白細胞介素-6 （interleukin 6，IL-6） 、白細胞介素-1 β（interleukin 1 β，IL-1 β） 、白細胞介素-10 （interleukin 10，IL-10） 和腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-alpha，TNF-α） ELISA試劑盒 （武漢USCN公司）；EGCG （中國阿拉丁試劑有限公司） 。

1.1.2 實驗動物分組及模型制備：清潔級SD大鼠，雄性，40只，體質量200～220 g，購自北部戰區總醫院實驗動物科，在屏障系統中飼養。動物實驗經北部戰區總醫院實驗動物福利倫理委員會批準。SD大鼠隨機分為4組：假手術組 （Sham組） 、LPS誘導急性腎損傷組 （AKI組） 、EGCG治療組 （EGCG組）和EGCG+LPS+TLR4抑制劑組 （TLR4組） ，每組10只。AKI組、EGCG組、TLR4組大鼠采用腹腔注射LPS （40 mg/kg） 建立內毒素血癥大鼠模型；EGCG組在建模前4 d每天灌胃EGCG （80 mg/kg） ，TLR4組在給予EGCG后腹腔注射TLR4抑制劑。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與檢測：各組大鼠于模型建立后6 h處死，取血液分離血清，一部分送檢驗科檢測尿素氮 （urea nitrogen，BUN）和血清肌酐 （serum creatinine，Cr） 含量，另一部分用于ELISA檢測，剩余部分用于鱟試劑合成基質偶氮顯色法 （試劑盒購于廈門市鱟試劑實驗廠有限公司）；取腎臟組織，一部分置于多聚甲醛中，另一部分低溫冰箱保存。

1.2.2 ELISA檢測血清中炎性細胞因子含量

按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中IL-6、IL-1 β、TNF-α和IL-10含量變化。依次倍比稀釋標準品建立標準曲線，加入待測樣本37 ℃孵育90 min，PBST洗滌；加入50 μ L酶標二抗，37 ℃孵育30 min；每孔加入顯色劑50 μ L，避光顯色15 min，每孔加入終止液50 μ L；酶標儀檢測，繪制標準曲線，計算樣品濃度。

1.2.3 HE染色檢測腎臟組織：組織進行脫水、透明、浸蠟后對心肌組織進行石蠟包埋，將包埋好的腎臟組織進行連續切片后，將切片脫蠟至水，蘇木素染色2～3 min后，鹽酸乙醇分化3～5 s，伊紅染色1 min，切片梯度脫水、透明后封片，顯微鏡下觀察腎臟組織的病理學變化。

1.2.4 實時PCR檢測：將收集的腎臟組織加入Trizol（美國Invitrogen公司，15596026） 溶液中，按照Trizol試劑操作說明書進行分離提取組織和細胞中的總RNA，反轉錄合成第一鏈cDNA （美國Thermo公司，K1622） 后，按照實時PCR （美國Qiagen公司，204057）法檢測TLR4、Myd88和NF-κ B，參照試劑盒說明書操作，引物由上海杰瑞生物公司合成，引物序列見表1。反應條件為95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，循環40次； 融解曲線分析95 ℃ 1 s，65 ℃ 15 s，95 ℃ 5 s。結果采用2-ΔΔCt計算。

表1 實時PCR引物Tab.1 Gene-specific primers used for qRT-PCR

1.2.5 Western blotting檢測：將腎臟組織置于含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中，于冰上對心肌組織進行勻漿，收集上清液后，使用BCA蛋白定量試劑盒進行定量，蛋白上樣行SDS-PAGE電泳、PVDF轉膜后，加入TLR4、Myd88和NF-κ B抗體 （1∶1 000） ，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h后，使用ECL發光試劑盒和凝膠成像系統對蛋白進行顯色，結果使用Image J軟件進行灰度分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 內毒素檢測

與Sham組LPS含量 （0.016±0.003） 相比，AKI組LPS含量 （0.372±0.015） 顯著升高，差異有統計學意義 （P ＜ 0.05）；與AKI組相比，EGCG組LPS含量 （0.132±0.012） 顯著降低，差異有統計學意義 （P ＜ 0.05）；與EGCG組相比，TLR4組LPS含量 （0.318±0.009） 顯著升高，差異有統計學意義 （P ＜ 0.05） 。

2.2 病理組織學變化

與Sham組相比，AKI組腎臟腎小管擴張、出現腎小球炎癥反應；與AKI組相比，EGCG組可明顯減輕腎臟損傷，腎小球炎癥減輕；加入TLR4抑制劑后，EGCG的作用減弱。見圖1。

圖1 HE染色檢測各組大鼠腎臟組織病理學變化 ×200Fig.1 Pathological changes in kidney tissues of rats from each group by HE staining ×200

2.3 腎功能檢測

與Sham組Cr （40.21±6.34）和BUN （6.07±0.71） 含量相比，AKI組Cr （130.34±11.23）和BUN （28.41±2.21）含量顯著升高，差異有統計學意義 （P ＜ 0.05）；與AKI組相比，EGCG組Cr （80.29±9.87）和BUN （19.22±2.31）含量顯著降低，差異有統計學意義 （P ＜ 0.05）；與EGCG組相比，TLR4組Cr （119.84±8.96）和BUN （23.27±1.71） 含量顯著升高，差異有統計學意義 （P ＜ 0.05） 。

2.4 炎性細胞因子檢測

與Sham組IL-6 （8.764±0.821） 、 IL-1 β （43.227±8.227） 、TNF-α （57.281±3.882） 和IL -10 （164.32±10.88） 水平相比，AKI組IL-6 （15.283±1.241） 、IL-1 β （262.273±26.942） 和TNF-α （195.517±11.423） 水平顯著升高，IL -10 （101.53±9.74） 水平降低，差異有統計學意義（P ＜ 0.05）；與AKI組相比，EGCG組IL-6 （10.642±0.912） 、IL-1 β （137.731±9.811） 和TNF-α （103.732±4.713） 水平顯著降低，IL -10 （184.33±8.93） 水平升高，差異有統計學意義 （P ＜ 0.05）；與EGCG組相比，TLR4組逆轉了EGCG的抑制炎癥反應作用，IL-6 （13.281±1.428） 、IL-1 β （198.732±18.742） 和TNF-α （136.832±9.883） 水平顯著升高，IL -10 （133.42±9.92） 水平降低，差異有統計學意義 （P ＜ 0.05） 。

2.5 腎臟組織中TLR4、Myd88和NF-κ B蛋白和mRNA表達水平

分別用實時PCR和Western blotting檢測TLR4、Myd88、NF-κ B蛋 白 和mRNA表 達，與Sham組TLR4、Myd88和NF-κ B蛋白 （0.39±0.048、0.31±0.035、0.71±0.063） 和mRNA （1±0、1±0、1±0） 表達相比，AKI組TLR4、Myd88和NF-κ B蛋白 （1.19±0.088、0.74±0.053、1.33±0.092） 和mRNA （1.832±0.084、1.721±0.056、1.984±0.093） 表達顯著增加，差異有統計學意義 （P ＜0.05）；與AKI組 相 比，EGCG組TLR4、Myd88、NF-κ B蛋白 （0.98±0.039、0.57±0.042、1.04±0.048） 和mRNA（1.432±0.071、1.503±0.072、1.573±0.066） 表達顯著降低，差異有統計學意義 （P ＜ 0.05）；與EGCG組相比，TLR4組TLR4、 Myd88、 NF-κ B蛋白 （0.68±0.055、0.42±0.038、 0.81±0.053） 和 mRNA （1.215±0.051、1.098±0.048、1.224±0.084） 表達顯著降低 （P ＜ 0.05） 。見圖2。

圖2 Western blotting法檢測腎臟組織中TLR4、Myd88和NF-κ B蛋白表達水平結果Fig.2 Western blotting results for the expression of TLR4，Myd88，and NF-κ B in rat kidney tissues.

3 討論

本研究利用LPS構建了內毒素AKI模型，LPS誘導的AKI主要病理生理學特征為內皮功能障礙，腎小球內血栓形成和腎小管損傷的腎實質中的嚴重炎癥反應。研究［11］表明LPS誘導的大鼠AKI，可以引起大鼠腎臟組織IL-6、TNF-α和IL-1 β等炎性細胞因子表達的上調，因此，抑制這些炎性細胞因子的表達可以預防LPS誘導的AKI。

EGCG作為強效的抗氧化劑和活性氧清除劑，已證實有強抗炎作用［12］。CHANG等［13］研究發現，用環孢菌素 （cyclosporine A，CsA） 誘導的腎毒性大鼠模型中，EGCG對由氧自由基引起的腎功能改變具有保護作用。EL-MOWAFY等［14］研究發現，EGCG可以通過抑制白細胞增多、全身炎癥、氧化應激來避免CP引起大鼠腎臟損傷。本研究結果顯示，EGCG預處理LPS引起的AKI，BUN和Cr的表達水平明顯下降，表明EGCG對大鼠腎臟具有明顯的保護作用。ELISA檢測結果表明，血清中IL-6、TNF-α和IL-1 β的表達也明顯下降。這些結果表明EGCG對LPS誘導AKI大鼠的腎臟保護是通過抑制腎臟組織中的炎性細胞因子來實現的。

TOLL樣受體作為一種參與全身免疫反應和炎癥反應的重要識別受體，能介導免疫細胞識別病原微生物，并引發全身免疫反應［15］。研究［16］表明，TLR4在LPS誘導的AKI動物模型中表達顯著增高，LPS誘導后TLR4水平的增加可能與炎性細胞因子介導的受體表達增加有關。本研究進一步探討了EGCG調控內毒素血癥大鼠腎臟炎癥反應的作用機制，結果顯示，EGCG能夠明顯抑制LPS誘導的TLR4的表達及下游因子Myd88和NF-κ B的活化。

綜上所述，本研究結果表明，EGCG可以明顯減輕LPS導致的大鼠腎損傷和全身炎癥反應，其作用機制可能與TLR4/Myd88/NF-κ B通路有關。