苦瓜總皂苷對心力衰竭大鼠心肌凋亡的影響

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心力衰竭(heart failure，HF)是臨床常見的一種心血管疾病，是各種心臟相關疾病的終末期結果，主要特點為心室功能下降以至于心臟排血功能不能滿足身體代謝所需要的一種病癥，在臨床中主要表現有呼吸困難、體力受限以及水腫等[1-2]。近年來心力衰竭呈相對高發的態勢，最新的研究顯示，目前我國成人心力衰竭患病率約為1.2%[3]。對于心力衰竭，中醫沒有明確的論述，也找不到等同于心力衰竭的較為確切的病名，在診斷時根據病人臨床表現，將其歸屬于“心悸”“心痹”“怔忡”“咳嗽”“喘證”“積聚”“痰飲”“水腫”及“虛勞”等范疇[4]。苦瓜是人們喜歡的一種蔬菜，有研究顯示苦瓜對“喘證”“水腫”及“虛勞”等癥狀有很好的調節作用[5]，苦瓜總皂苷是從苦瓜中提取的一種皂苷類混合物，有文獻報道苦瓜總皂苷對心肌損傷的作用[6]，但將其用于慢性心力衰竭的研究較少，本研究采用苦瓜總皂苷治療鹽酸異丙腎上腺素(ISO)引起的慢性心力衰竭大鼠，觀察其對心肌組織凋亡因子Caspase-8、Bcl-2表達的影響，以探討苦瓜總皂苷治療慢性心力衰竭的部分作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器

1.1.1 實驗動物 雄性清潔級SD大鼠60只，大鼠體重200 g左右，購于華中科技大學同濟醫學院動物實驗中心，大鼠在購買后飼養于江漢大學動物實驗房，按照標準條件飼養。

1.1.2 實驗試劑 鹽酸異丙腎上腺素注射液購于上海禾豐制藥有限公司；苦瓜總皂苷購于湖北天合化工有限公司；大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)酶聯免疫(ELISA)檢測試劑盒購于武漢博士德生物有限公司；兔抗大鼠Caspase-8抗體、兔抗大鼠Bcl-2抗體以及兔抗大鼠β-actin抗體購于美國Santa公司；上述抗體對應2抗、兔SP即用型檢測試劑盒以及3，3′-二氨基聯苯胺(3，3′-diaminobenzidine，DAB)試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒和總蛋白提取試劑盒、總RNA提取試劑盒購于北京天根生物公司；引物由上海英俊生物公司設計并生產。

1.1.3 實驗儀器 Histostar型全自動包埋機[新發現科技(中國)有限公司]；CUT4062型石蠟切片機(德國SLEE)；CX23型光學顯微鏡[奧林巴斯(中國)有限公司]；低溫高速型離心機(北京時代北利離心機有限公司)；-20 ℃以及-80 ℃冰箱(海爾公司)；AE200S型電子分析天平(美國梅特勒-托利多儀器有限公司)；Benchmark Pl型酶標儀(美國BioTek公司)；Bio-rad蛋白電泳儀(美國伯樂公司)；Applied Biosystems pcr儀(上海賽默飛世爾公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組方法 60只大鼠適應性喂養14 d后，按照隨機數字表法分為正常組、模型組及苦瓜總皂苷低、中、高劑量治療組，每組12只。

1.2.2 造模方法 除正常組外，其余4組給予造模；造模前給予大鼠12 h禁食不禁水，根據文獻[7]報道的方法構建心力衰竭大鼠模型，具體為給予大鼠皮下多點注射鹽酸異丙腎上腺素85 mg/kg，24 h后相同注射部位再注射1次。1 d后檢驗造模是否成功。造模成功的標準為B超檢驗結果有明顯的心功能異常。

1.2.3 治療方法 造模成功后給予對應治療。正常組和模型組給予生理鹽水0.5 mL/(kg·d)皮下注射；苦瓜總皂苷低、中和高劑量組分別給予苦瓜總皂苷10 mg/(kg·d)、 20 mg/(kg·d)和40 mg/(kg·d)皮下注射。均治療8周。

1.2.4 一般情況觀察 從造模前到處死大鼠整個過程中，密切監視大鼠的日常情況，主要為精神狀態、毛色光澤度、毛發是否粘連、飲水和攝食量等。

1.2.5 心功能測定 治療結束后，給予大鼠禁食，限制飲水12 h，稱重后腹腔注射30 mg/kg的3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，大鼠麻醉后固定于解剖板上，切開頸部，將右頸總動脈分離后，內充含有0.1%肝素的生理鹽水導管插入左心室，穩定 20 min后，基于RM6240多道生物信號采集系統，記錄收集到的壓力曲線，同時根據公式計算平均心室舒張壓(LVDP)、平均左室峰壓(LVSP)、心室內壓最大上升速率(+dp/dtmax)及平均等容舒張期室內壓最大下降速率(-dp/dtmax)。

1.2.6 ELISA法檢測大鼠血清 TNF-α 、IL-6水平 剖開大鼠腹腔，找到腹主動脈，用10 mL注射器小心抽取血液置于1.5 mL的離心管中3 000 r/min離心10 min，離心后保留上清液，按照試劑盒說明書，用ELISA法測定TNF-α 、IL-6。

1.2.7 心肌組織蘇木精-伊紅染色(HE染色) 將大鼠胸膈膜剖開，摘取心臟，用生理鹽水反復沖洗后，切取心尖處約四分之一置于中性甲醛溶液中固定(其余放入凍存管中保存備用于相關蛋白和mRNA的檢測)24 h，24 h后取出用石蠟包埋，切片、HE染色即可。

1.2.8 免疫組化方法檢測大鼠心肌Caspase-8、Bcl-2蛋白的表達 免疫組化法檢測大鼠心肌Caspase-8、Bcl-2蛋白表達和分布時所用切片也為上述所得的石蠟切片。石蠟切片得到后使用二甲苯脫蠟、梯度乙醇沖洗后使其水化，之后用枸櫞酸鹽緩沖液修復抗原，3%過氧化氫促使心臟切片中殘留的內源性過氧化物酶活性阻斷，上述完成后用蒸餾水洗滌，加入一抗孵育、洗滌、加入二抗。孵育洗滌、DAB顯色、蘇木素復染、脫水、透明、封片即完成。

1.2.9 Western印跡檢測蛋白表達 準確取1 g心臟組織，用組織裂解液和總蛋白提取液將組織充分的研磨裂解，后采用冷凍離心機4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，提取上清液用BCA試劑盒對其進行定量后，調平置于低溫冰箱中保存，檢測時使用10%的ADS-PAGE凝膠電泳中電泳即可，電泳完成后轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h后洗滌3次，之后加入相應一抗過夜后洗滌3次，加入對應二抗孵育2 h后洗滌3次，電致化學發光(ECL)發光試劑后曝光壓片、顯影定影、掃描儀掃描圖片后采用Image J計算每個條帶的熒光強度值，每組實驗重復3次，結果以測定蛋白的熒光強度值/β-actin的熒光強度值比較即可。

1.2.10 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測 mRNA表達 每組精密稱取100 mg心臟組織，采用一步法提取總RNA并純化，電泳確定條帶后定量調平，每組各取2 μg進行逆轉錄合成cDNA，行qRT-PCR，比較以β-actin為內參照。引物序列設計為：TNF-α上游引物為5′-TCTCATTCCTGCTTGTGGC-3′，下游引物為5′-GCT GGCCCACTAGTTGGTT-3′；NT-proBNP上游引物為5′-ATGAAATATACAAGTTATATG-3′，下 游 引 物 為5′TTACTGGGATGCTCTTCGAC-3′；β-actin上游引物為5′-TCATGAAGT GTGACGTTGACATCCGTAAAG-3′，下游引物為3′- CCTAGAAGCATTTGCGGTGCA CGATGGAGG-5′，用2-ΔΔCt測定的數值比較并分析各組大鼠心臟組織中TNF-α、NT-proBNP的mRNA相對表達量。

2 結 果

2.1 大鼠一般情況 正常組大鼠日常活動、飲水和進食均正常，同時毛色發白沒有粘連；模型組大鼠則出現典型的心肌損害癥狀，主要表現為精神萎靡，飲水量、進食量均明顯降低，日常蜷臥于角落；苦瓜總皂苷低、中、高劑量治療組上述癥狀較模型組明顯輕。

2.2 各組大鼠心功能指標比較(見表1)

表1 大鼠心功能指標比較(±s)

注：1 mmHg=0.133 kPa，與正常組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

2.3 各組大鼠炎性因子TNF-α、IL-6水平比較(見表2)

2.4 各組大鼠HE染色結果比較 大鼠心臟組織HE染色可見，正常組大鼠心肌細胞排列整齊，細胞質和細胞間質沒有明顯的膨大；而模型組則有明顯的心肌受損，細胞排列紊亂，同時細胞核大小不均一，部分細胞核固縮；苦瓜總皂苷低、中、高劑量治療組心肌組織較模型組均有不同程度的改善。詳見圖1。

表2 各組大鼠炎性因子TNF-α、IL-6水平比較(±s) pg/mL

與正常組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

2.5 各組大鼠Bcl-2、Caspase-8表達特點 正常組大鼠心肌細胞中僅有少量Bcl-2、Caspase-8被標記，同時其表達分布均勻；而模型組Bcl-2分泌并沒有明顯增加，Caspase-8分泌則明顯增加；苦瓜總皂苷低、中、高劑量治療組Bcl-2表達較模型組分泌明顯增加，同時隨著給藥劑量的增加，Caspase-8的分泌呈明顯降低趨勢。詳見圖2。

2.6 各組大鼠Bcl-2、Caspase-8蛋白表達水平比較 與正常組比較，模型組大鼠心肌組織中Bcl-2蛋白表達明顯下降(P<0.05)，Caspase-8 蛋白表達明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，苦瓜總皂苷低、中、高劑量治療組Bcl-2蛋白表達逐漸升高，且中、高劑量組明顯高于正常組，差異均有統計學意義(P<0.05)。苦瓜總皂苷低、中、高劑量組Caspase-8蛋白表達較模型組明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖3、表3。

表3 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Caspase-8蛋白的相對表達量比較(±s)

組別只數Bcl-2Caspase-8正常組 121.14±0.24 0.42±0.13 模型組 90.57±0.341)2.12±0.161)苦瓜總皂苷低劑量組101.19±0.282)1.76±0.211)2)苦瓜總皂苷中劑量組101.37±0.271)2)1.43±0.161)2)苦瓜總皂苷高劑量組111.55±0.301)2)0.72±0.171)2)

與正常組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

2.7 各組大鼠Bcl-2、Caspase-8 mRNA表達水平比較 與正常組比較，模型組大鼠心肌組織中Bcl-2 mRNA表達明顯下降(P<0.05)，Caspase-8 mRNA表達明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，苦瓜總皂苷低、中、高劑量組Bcl-2 mRNA表達逐漸升高，且均明顯高于正常組，差異均有統計學意義(P<0.05)；Caspase-8 mRNA表達則明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Caspase-8 mRNA表達水平比較(±s)

與正常組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

3 討 論

慢性心力衰竭大鼠的造模國內外均有大量的研究，目前比較流行的主要有結扎左冠狀動脈法、主動脈縮窄法以及阿霉素或去甲腎上腺素等藥物促成法[7-10]。但在實際應用過程中發現結扎左冠狀動脈和主動脈縮窄法等雖然可以較好地模擬人體的慢性心力衰竭過程，但是其操作方法難度較大，動物死亡率也較高。相對而言，阿霉素或者去甲腎上腺素則簡單實用，因此，在基礎醫學領域較為常用，其中采用去甲腎上腺素可以準確地模擬腎心損傷模型，因此更為常用。有研究顯示采用去甲腎上腺素制備的模型其心肌病理學、心肌酶譜、相關激素水平以及血流動力學更接近于人體，因此，將本模型用于藥理學研究可以較好地評價藥物藥理學和藥效學[11]。本研究采用鹽酸異丙腎上腺素注射建立心力衰竭模型，造模中可見大鼠在注射鹽酸異丙腎上腺素后表現有明顯的精神萎靡，活動量降低，鼻腔出血，飲食量降低，蜷臥，氣喘，毛發疏松且無光澤等。此外，在造模結束后對大鼠行血流動力學檢查，可見大鼠+dp/dtmax明顯降低，提示采用本方法所構建的心力衰竭模型很好地模擬了人體心力衰竭的特點，為苦瓜總皂苷的開發奠定了較好的基礎。

目前的研究認為慢性心力衰竭的危害依然是凋亡，凋亡簡單來說就是細胞的生理性死亡，其本來是維持機體正常新陳代謝的一種正常的過程，但是當受到一些外在或內在因素刺激時凋亡會給機體帶來不可避免的損傷[12]，而在凋亡發生過程中，Caspase家族和Bcl-2家族蛋白在其中發揮重要的作用，在Caspase家族蛋白中，Caspase -8屬于上游激活蛋白，其激活可以誘導下聯其他Caspase家族蛋白(Caspase-3、Caspase-6及Caspase-9等)的激活，最終促進凋亡的發生。Bcl-2家族蛋白則根據其功能的不同分為兩大類，分別為抗凋亡相關蛋白(Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w和Mcl-1)和促進凋亡相關蛋白(Bax、Bak、Bad和Bid)。在體內Bcl-2除可以和Bax結合形成共聚體來發揮抗凋亡作用外，還可以抑制Caspase家族蛋白的激活，因此，在凋亡中具有十分重要的地位[13-15]。

中醫學認為苦瓜氣味苦、無毒、性寒，主要入心、脾、肝、肺經，有清熱祛暑、明目解毒、利尿涼血、解勞清心、益氣壯陽之功效；苦瓜總皂苷是苦瓜中提取的一類皂苷類化合物。2007年柴瑞華等[16]研究報道苦瓜總皂苷可以明顯降低2型糖尿病動物模型的血糖。莫灼康等[17]研究報道，苦瓜總皂苷對高血脂動物模型具有很好的調節作用。關于苦瓜總皂苷對心肌的作用也有報道，如朱定君等[18-19]研究報道，苦瓜總皂苷對糖尿病心肌損傷大鼠凋亡具有明顯的抑制作用，且對心肌損傷大鼠金屬基質蛋白酶也有很好的調節作用。但目前關于苦瓜總皂苷用于心力衰竭的研究報道較少，因此，本研究采用苦瓜總皂苷治療慢性心力衰竭大鼠，結果發現苦瓜總皂苷治療8周可以明顯改善慢性心力衰竭大鼠的怠倦活動狀態，改善大鼠心臟血流動力學指數，降低大鼠血清炎性因子，提示苦瓜總皂苷對慢性心力衰竭大鼠日常精神狀態及心功能的改善具有積極的意義。此外，苦瓜總皂苷能夠降低Caspase-8蛋白和mRNA表達，提高Bcl-2蛋白和mRNA表達，提示苦瓜總皂苷可以延緩心肌凋亡，進而對受損的心肌起到很好的保護作用。

本研究采用苦瓜總皂苷治療鹽酸異丙腎上腺素所致的心力衰竭大鼠，可以明顯改善心肌組織中Caspase-8、Bcl-2蛋白和mRNA的表達，此外還可以降低炎癥反應，保護心臟。