丹參多酚酸鹽對大鼠心肌缺血再灌注后心肌細胞凋亡的抑制作用及機制研究

中藥丹參味苦、微寒，具有活血通絡、祛瘀止痛、涼血消癰、清心除煩之功效，常用于心血管系統疾病的預防與治療[1]。丹參多酚酸是丹參的有效成分之一。王強等[2]研究發現丹參多酚酸能夠通過降低氧化應激損傷、抑制神經細胞凋亡而對實驗性腦缺血再灌注損傷大鼠模型具有一定的神經保護作用，但關于丹參多酚酸對心肌組織缺血再灌注后細胞凋亡的影響文獻報道尚不多見。本實驗擬通過復制心肌缺血再灌注大鼠模型，研究丹參多酚酸鹽對心肌缺血再灌注后細胞凋亡的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥物與試劑 實驗用大鼠(品系SD大鼠，清潔級，雄性，鼠齡8周齡，220～260 g)購自河北省實驗動物中心[SCXK(冀)2013-1-003]。丹參多酚酸鹽購自上海綠谷制藥有限公司(規格：每瓶50 mg)。2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)購自美國Sigma公司；蘇木素-伊紅(HE)試劑盒、缺口末端標記(TUNEL)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3多克隆抗體購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組、模型制備與給藥 設假手術組、模型組、丹參多酚酸鹽各劑量組(分別予10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg)，每組20只。通過夾閉左冠狀動脈前降支復制心肌缺血再灌注大鼠模型，心電圖示ST段抬高或T波高聳為心肌缺血，夾閉30 min后松開動脈夾，ST段或T波恢復表示再灌注成功[3]；假手術組大鼠除不夾閉左冠狀動脈前降支外，其余操作同模型組。丹參多酚酸鹽各劑量組腹腔注射給藥治療，每日1次，療程7 d。

1.2.2 心肌梗死面積測定 取心臟組織后放置于-20 ℃冰箱20 min，切片，置2% TTC溶液(恒溫37 ℃)避光孵育15 min，灰白色為梗死區，通過醫學成像軟件計算梗死面積。

1.2.3 心肌組織病變及細胞凋亡的觀察 制備心肌組織蠟塊并切片，經脫蠟水化后，通過HE染色及倒置光學顯微鏡觀察進行組織病理學檢查，通過TUNEL染色觀察細胞凋亡狀況。凋亡指數(AI)計算：每張切片選取不重疊的6個視野計數細胞總數和凋亡細胞數，計算AI，AI(%)=(陽性細胞數/細胞總數)×100%，各組分別計算平均值。

1.2.4 蛋白質免疫印跡(western blotting)法檢測凋亡相關蛋白表達 取心肌組織并研磨勻漿，經4℃、12 000 r/min離心20 min處理后取沉淀，行80 ℃高溫蛋白變性后進行電泳、轉膜、春紅溶液染色，脫脂奶粉封閉2 h，一抗Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3、β-actin(1∶500)4 ℃過夜；洗膜，二抗(1∶100)室溫搖床孵育1 h后經增強化學發光法(ECL)顯色。根據條帶灰度值，以β-actin為內參半定量分析凋亡相關蛋白表達。

2 結 果

2.1 各組心電圖監測結果比較 與假手術組比較，模型組及丹參多酚酸鹽各劑量組大鼠術后左心室前壁呈灰白色并漸變為發紺癥狀，心電圖示ST段抬高或T波高聳，提示造模成功。丹參多酚酸鹽各劑量組心電波形均明顯改善，其中丹參多酚酸鹽40 mg/kg組波形接近正常。詳見圖1。

A：假手術組；B：模型組；C：丹參多酚酸鹽10 mg/kg組；D：丹參多酚酸鹽20 mg/kg組；E：丹參多酚酸鹽40 mg/kg組

2.2 各組心肌組織梗死面積比較 與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織梗死面積明顯升高(P<0.05)；丹參多酚酸鹽20mg/kg組、40mg/kg組大鼠心肌組織

梗死面積較模型組顯著降低(P<0.05或P<0.01)；丹參多酚酸鹽10 mg/kg組梗死面積與模型組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心肌組織梗死面積比較(±s) %

模型組與假手術組比較，1)P<0.05；各劑量組與模型組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

2.3 各組心肌組織病變情況比較 假手術組大鼠心肌組織未見明顯異常；模型組大鼠心肌組織出現肌原纖維斷裂、排列紊亂，細胞空泡變性，細胞質著色不均，胞核深染等病理性改變；丹參多酚酸鹽各劑量組大鼠心肌組織病變較模型組呈現不同程度改善，以丹參多酚酸鹽40mg/kg組效果最為顯著。詳見圖2。

A：假手術組；B：模型組；C：丹參多酚酸鹽10 mg/kg組；D：丹參多酚酸鹽20 mg/kg組；E：丹參多酚酸鹽40 mg/kg組

2.4 各組心肌細胞凋亡情況比較 模型組心肌細胞凋亡數量較假手術組明顯增多；丹參多酚酸鹽各劑量組心肌細胞凋亡數量明顯減少，以丹參多酚酸鹽40 mg/kg組最為顯著。模型組大鼠心肌細胞AI較假手術組顯著升高(P<0.01)；丹參多酚酸鹽20 mg/kg組、40 mg/kg組AI較模型組顯著降低(P<0.05或P<0.01)；丹參多酚酸鹽10 mg/kg組AI與模型組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2、圖3。

表2 各組大鼠心肌細胞AI比較(±s) %

模型組與假手術組比較，1)P<0.01；各劑量組與模型組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

A：假手術組；B：模型組；C：丹參多酚酸鹽10 mg/kg組；D：丹參多酚酸鹽20 mg/kg組；E：丹參多酚酸鹽40 mg/kg組

2.5 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3蛋白表達檢測結果比較 模型組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax蛋白、激活型Caspase-3蛋白較假手術組顯著上調表達(P<0.05或P<0.01)，Bcl-2/Bax比值較假手術組顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，丹參多酚酸鹽20 mg/kg組、40 mg/kg組能顯著上調抑凋亡蛋白Bcl-2表達，且顯著下調促凋亡蛋白Bax表達(P<0.05或P<0.01)，提高Bcl-2/Bax值(P<0.01)，顯著下調促凋亡蛋白激活型Caspase-3蛋白表達(P<0.05或P<0.01)。詳見表3、圖4。

表3 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3蛋白表達(±s)

模型組與假手術組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；各劑量組與模型組比較，3)P<0.05，4)P<0.01

A：假手術組；B：模型組；C：丹參多酚酸鹽10 mg/kg組；D：丹參多酚酸鹽20 mg/kg組；E：丹參多酚酸鹽40 mg/kg組

3 討 論

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病及其繼發性急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)發病率隨著高血壓、高血脂等基礎疾病發病率的上升而逐年升高，已經發展成為不容忽視的健康問題。目前，藥物或手術溶栓仍是臨床上應對AMI的首選方案，但溶栓后血管再通所引發的血流再灌注損傷卻成為影響預后的主要因素。血流再灌注損傷的形成機制極為復雜，其中明確的有氧化應激、炎癥、心肌細胞凋亡等[4-8]。

結扎左冠狀動脈前降支是實驗室常用的制備心肌缺血再灌注動物模型的方法，造模過程中進行心電圖實時監測，ST段抬高或T波高聳為心肌缺血典型表現，該造模方法操作簡單、成功率與重復率雙高[9]。本研究發現模型組大鼠術后左心室前壁呈灰白、發紺癥狀，心電圖示ST段抬高或T波高聳，提示造模成功。既往研究發現丹參多酚酸具有抗凋亡、抗氧化、抗炎等多種藥理學作用[2，10-11]。心肌缺血再灌注大鼠經丹參多酚酸鹽治療能夠有效改善心電圖，抑制心肌組織病變，減小梗死面積，提示丹參多酚酸鹽具有抑制心肌缺血再灌注損傷的作用。

促凋亡蛋白激活型Caspase-3、Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2在細胞凋亡過程中發揮著重要的調控作用[12]，其中Bcl-2和Bax同屬Bcl-2基因家族。Bcl-2通過抑制細胞色素C釋放、調節細胞內鈣濃度而表現出抑凋亡作用[13]；Bax通過破壞線粒體膜滲透性、激活促凋亡蛋白激活型Caspase-3而表現出促凋亡作用[14]；同源的Bax和Bcl-2能夠聚合形成同源二聚體而彼此抑制對方的活性，因此Bax、Bcl-2的相對含量更能反映二者在細胞凋亡過程中所起到的調控作用[15]。本研究發現，心肌缺血再灌注大鼠經丹參多酚酸鹽治療能明顯上調抑凋亡蛋白Bcl-2表達，下調促凋亡蛋白Bax和激活型Caspase-3表達，提高Bax/Bcl-2值，這可能是丹參多酚酸鹽抑制心肌缺血再灌注大鼠心肌細胞凋亡的重要分子機制之一。

丹參多酚酸鹽對心肌缺血再灌注大鼠心肌細胞凋亡具有抑制作用，可能與其調節凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3表達有關。