霉酚酸酯對阿霉素腎病大鼠的保護作用及其機制研究*

王興 ，白明輝 ，季佳 ，鄒艷紅 ，楊菲 ，鄧李玲 ，范琳博，劉瑤，邱迪，劉秋紅

（1.齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院 兒科，黑龍江 齊齊哈爾 161000；2.齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院 口腔科，黑龍江 齊齊哈爾 161000；3.佳木斯大學附屬第一醫院 兒科，黑龍江 佳木斯 154002）

霉酚酸酯（mycophenolatemofeitil, MMF）是臨床上治療腎病綜合征（nephrotic syndrome, NS）的常用藥物[1-3]。大量研究證實，足細胞不可逆損傷是NS患者出現蛋白尿的主要機制之一，因此修復和保護足細胞是阻止腎功能惡化的主要策略[4]。microRNAs（miRNAs）在多種腎疾病發生、發展過程中扮演重要角色[5]。尋找MMF靶向調控的miRNAs分子對明確MMF的作用機制具有重要臨床意義。筆者首先采用基因芯片技術，篩選與NS密切相關的miRNAs作為候選標志物，并通過探討MMF對阿霉素腎病（adriamycin nephropathy, ADN）大鼠模型足細胞的保護作用，以及對腎組織miRNAs的影響，闡明MMF的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只6～8周齡成年健康SPF級Sprague-Dawley（SD）大鼠購自廣州醫藥研究總院有限公司，動物許可證號：SYXK（粵）2013-0003。體重180～220 g，平均（192.46±6.13）g。將大鼠分籠飼養，3或4只/籠，喂以標準飼料及消毒的自來水，自由活動與進食、進水，保證動物房內安靜、清潔、通風，溫度控制在（22±1）℃。

1.2 受試藥物與主要試劑

注射用鹽酸多柔比星（阿霉素）（浙江海正藥業股份有限公司），MMF（上海羅氏制藥有限公司），PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供，miRelute miRNA 提取分離試劑盒、RT Reagent Kit、cDNA合成試劑盒、SYBR實時熒光定量聚合酶鏈反 應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）試劑盒購自日本TaKaRa公司，組織蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、DAB顯色試劑盒、TUNEL染色試劑盒購自北京天根科技生化有限公司，Trizol（美國Invitrogen公司），DEPC（美國Sigma公司），兔抗鼠Nephrin單克隆抗體、ZO-1兔抗鼠多克隆抗體、Podoplanin兔抗鼠多克隆抗體購自美國Abcam公司，辣根過氧化物酶標記二抗（北京中杉金橋生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器

Eppendorf 5427 R 臺式高速冷凍離心機、各種型號的移液器購自德國Eppendorf公司，CFX-96-C1000 qRT-PCR 儀、miRNA PCR Array Data Analysis Software、iMake多功能酶標儀、SDS-PAGE電泳儀及電轉膜儀購自美國Bio Rad公司，CX41倒置光學顯微鏡（日本Olympus公司），AUW120電子分析天平（日本島津公司），Amersham電泳儀（瑞典Bioscience公司），LAS-4000 min凝膠成像數碼分析系統（日本FUJIFILM公司）。

1.4 動物模型的復制與分組

經過為期1周的適應性飼養后，稱量并記錄大鼠體重，按照隨機數字表法，將60只SD大鼠隨機分為空白對照組（CTL組）、ADN模型組（ADN組）和MMF干預組（MMF組），每組20只。ADN組和MMF組大鼠都屬于ADN模型，筆者按照參考文獻[6]的方法，一次性尾靜脈注射6.5 mg/kg阿霉素溶液（0.2%）復制ADN模型；而CTL組大鼠以同樣的方式注射生理鹽水作為對照。1周后收集大鼠24 h尿液，測定24 h 尿蛋白量，尿蛋白 ＞30 mg/24 h 則表示模型復制成功。最終，ADN組和MMF組分別有18和19只大鼠模型復制成功，用于后續實驗。

1.5 藥物干預

每日觀察受試大鼠進食、排便、活動、精神狀況等，稱重1次/d。根據動物體重計算當日給藥量。CTL組和ADN組：每天灌胃無菌生理鹽水，1 ml/100 g，1 次 /d，連續給藥 28 d。MMF 組：每天灌胃 1% MMF 溶液，20 mg/kg，1 次 /d，連續給藥 28 d。

1.6 標本采集與檢測

1.6.1 腎功能 給藥第 0、7、14、21 和 28 天時，用代謝籠采集大鼠24 h尿液，檢測尿蛋白。實驗結束時，經尾靜脈采集外周血3 ml，置于枸櫞酸鈉真空采集管中，檢測各組大鼠血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、血清肌酐（serum creatinine, Scr）水平。

1.6.2 腎組織病理學檢查 待實驗結束時，將大鼠頸椎脫臼處死，取出腎組織，用10%甲醛固定，包埋成蠟塊。脫蠟水化后，用石蠟切片機切片，厚約2μm，置于載玻片上。烘干48 h后，進行HE、PAS或Masson染色，觀察腎組織病理學變化。

1.6.3 大鼠腎臟細胞凋亡情況 按照 TUNEL 染色試劑盒說明書進行操作，置于光學倒置顯微鏡下觀察腎組織細胞凋亡情況。

1.6.4 大鼠腎組織 miRNAs芯片分析 取大鼠腎組織提取總RNA：取100 mg組織樣本置于EP管中，加入MZ裂解液，按照miRelute miRNA提取分離試劑盒說明書步驟進行操作；采用凝膠電泳檢測RNA分子量，分光光度計檢測RNA濃度。測定濃度和純度后進行miRNAs芯片分析，后續操作委托上海康成生物工程有限公司完成。

1.6.5 腎組織 miRNAs ①提取腎組織總 RNA：實驗方法同1.6.4。②RNA逆轉錄：根據逆轉錄試劑盒說明書操作進行。將cDNA保存至-20℃備用。③qRT-PCR：按照三步法進行PCR擴增。以組織cDNA為模板，以β-actin為內參，將20μl反應體系置于 37℃恒溫水浴 60 min，85℃、5 s，加入去離子水至100μl，各反應孔取2μl進行PCR。冰浴中配制 20μl PCR 反應體系，反應條件：95℃預變性 30 s，95℃變性 5 s，60℃退火 30 s，共 45 個循環。根據NCBI數據庫獲得的資料設計引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供。PCR結果判斷：根據使用說明調整基線，將閾值設定在熒光值對數圖的線性部分，從軟件中讀取Ct值。

1.7 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計學軟件。計量資料以（±s）表示，多組比較用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，方差不齊則采用Kruskal-Wallis非參數檢驗。采用Pearson相關性分析miRNAs與尿蛋白的相關性，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況及體重變化

實驗過程中，CTL組大鼠飲食和活動正常；ADN組大鼠出現食欲減退、水腫、脫毛等情況，甚至有2只大鼠出現明顯的腹水；與CTL組大鼠相比，MMF組大鼠雖然也存在食欲減退、生長遲緩的情況，但是較ADN組大鼠輕。比較3組大鼠給藥后0、7、14、21和28 d的體重變化，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的大鼠體重比較，差異有統計學意義（F=243.451，P=0.000）；②3組大鼠體重比較，差異有統計學意義（F=28.752，P=0.000）；③ 3組大鼠體重變化趨勢比較，差異有統計學意義（F=11.594，P=0.000）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，自給藥7 d起，ADN組和MMF組大鼠體重低于CTL組大鼠（P＜0.05）；同時MMF組大鼠平均體重高于AND組（P＜0.05）。見表 1 和圖 1。

2.2 各組大鼠尿蛋白的變化

3組大鼠尿蛋白含量比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點尿蛋白含量比較，差異有統計學意義（F=735.62，P=0.000）；② 3組大鼠尿蛋白含量比較，差異有統計學意義（F=28.769，P=0.000）；③3組大鼠的尿蛋白含量變化趨勢比較，差異有統計學意義（F=54.678，P=0.000）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，給藥當天，ADN組和MMF組大鼠尿蛋白含量高于CTL組（P＜0.05）；ADN組和MMF組大鼠尿蛋白含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；但是自給藥7 d后，雖然MMF組大鼠尿蛋白含量仍然高于CTL組，但是低于ADN組（P＜0.05）。見表2和圖2。

表1 各組大鼠不同時間點的體重比較 （g，±s）

表1 各組大鼠不同時間點的體重比較 （g，±s）

注：1）與CTL組比較，P＜0.05；2）與ADN 組比較，P＜0.05

組別 n 給藥后0 d 給藥后7 d 給藥后14 d 給藥后21 d 給藥后28 d CTL 組 20 224.01±5.21 237.30±8.16 250.30±9.40 265.61±9.17 285.05±12.81 ADN組 18 210.39±6.23 219.00±10.461） 228.67±15.491） 234.06±23.291） 237.78±28.851）MMF 組 19 212.42±6.61 223.42±10.251）2） 234.37±12.251）2） 245.21±18.081）2） 263.32±22.341）2）

圖1 各組大鼠體重變化趨勢 （±s）

表2 各組大鼠不同時間點的尿蛋白比較 （mg/24 h，±s）

表2 各組大鼠不同時間點的尿蛋白比較 （mg/24 h，±s）

注：1）與CTL組比較，P＜0.05；2）與ADN 組比較，P＜0.05

組別 n 給藥后0 d 給藥后7 d 給藥后14 d 給藥后21 d 給藥后28 d CTL 組 20 18.85±5.69 19.47±5.22 17.13±6.91 17.45±7.47 18.26±6.29 ADN 組 18 40.13±11.081） 95.87±23.711） 142.39±45.461） 229.35±76.151） 240.11±106.021）MMF 組 19 40.72±9.341） 51.56±16.421）2） 58.96±15.651）2） 61.71±16.231）2） 60.78±19.871）2）

圖2 各組大鼠尿蛋白變化趨勢 （±s）

2.3 各組大鼠生化指標比較

實驗結束時，3組大鼠外周血BUN和Scr水平比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，ADN組、MMF組大鼠血清BUN和Scr含量高于CTL組（P＜0.05）；與ADN組比較，MMF組大鼠血清BUN和Scr含量降低（P＜0.05）。見表 3。

表3 各組大鼠生化指標比較 （±s）

表3 各組大鼠生化指標比較 （±s）

注：1）與CTL 組比較，P＜0.05；2）與ADN組比較，P＜0.05

組別 n BUN/（mmol/L） Scr/（μmol/L）CTL組 20 7.59±0.74 29.75±2.56 ADN組 18 18.12±0.831） 62.53±2.981）MMF 組 19 14.65±0.791）2） 38.27±2.611）2）F值 894.48 732.59 P值 0.000 0.000

2.4 各組大鼠腎組織病理學變化

光鏡下觀察CTL組大鼠腎小球形態基本正常，未見系膜增生，上皮細胞足突清晰可見；而ADN組大鼠腎小球肥大，系膜細胞增生，上皮細胞足突廣泛融合，毛細管腔狹窄，間質出現輕、中度纖維化；MMF組大鼠腎小球變化較ADN組輕，但是與CTL組比較，仍可見明顯差異。見圖3。

2.5 各組大鼠腎組織細胞凋亡情況

TUNEL熒光染色定位于細胞核。CTL組、ADN組、MMF組大鼠腎組織細胞凋亡率分別為（3.56±1.32）%、（31.75±6.44）%和（14.73±5.18）%，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=172.608，P=0.000）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，ADN組大鼠腎組織細胞凋亡率高于CTL組（P＜0.05）；MMF組大鼠腎組織細胞凋亡率雖然高于CTL組（P＜0.05），但是低于ADN組（P＜0.05）。見圖 4、5。

2.6 各組大鼠腎組織miRNAs芯片分析結果

采用GenePix Pro 6.0讀取芯片掃描結果，提取探針信號值，將相同的探針值中值合并，對芯片結果進行中值標準化，篩選差異表達的miRNAs（Fold＞1.5且P＜0.05）。各組芯片之間信號強度相關性分析：CTL組與ADN組的相關系數為0.715，ADN組與MMF組的相關系數為0.632，CTL組與MMF組的相關系數為0.979。與CTL組相比，ADN組主要有19個miRNAs表達上調，23個miRNAs表達下調。與ADN組相比，MMF組主要有7個miRNAs表達上調，8個miRNAs表達下調。其中，相較于CTL組，ADN組大鼠腎組織中rno-miR-23a和rno-miR-300-3p表達上調，rnomiR-24、rno-miR-300-3c表達下調，而與ADN組相比，MMF組大鼠腎組織中rno-miR-24、rno-miR-300-3c表達上調，rno-miR-23a和rno-miR-300-3p表達下調。見圖6。

圖3 各組大鼠腎組織病理學變化

圖4 各組大鼠腎組織細胞凋亡情況 （TUNEL×400）

圖5 各組大鼠腎組織細胞凋亡率比較 （±s）

2.7 各組大鼠腎組織miRNAs含量比較

3組大鼠腎組織rno-miR-23a、rno-miR-300-3p、rno-miR-24、rno-miR-300-3c表達水平比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，與CTL組相比，ADN組大鼠腎組織rno-miR-23a和rno-miR-300-3p表達上調（P＜0.05）， 而 rno-miR-24 和 rno-miR-300-3c下調（P＜0.05）；與ADN組相比，MMF組大鼠腎組織rno-miR-24 和 rno-miR-300-3c表達上調（P＜0.05），rno-miR-23a和rno-miR-300-3p下調（P＜0.05）。見表4。

圖6 層次聚類圖

2.8 大鼠腎組織miRNAs與尿蛋白的相關性

經Pearson相關性分析，rno-miR-23a、rno-miR-300-3p與尿蛋白呈正相關（r=0.773和0.695，均P=0.000）；而rno-miR-24、rno-miR-300-3c與尿蛋白呈負相關（r=-0.664 和 -0.647，均P=0.000）。

表4 各組大鼠腎組織miRNAs表達水平比較 （±s）

表4 各組大鼠腎組織miRNAs表達水平比較 （±s）

注：1）與CTL組比較，P＜0.05；2）與ADN 組比較，P＜0.05

組別 n rno-miR-23a rno-miR-300-3p rno-miR-24 rno-miR-300-3c CTL 組 20 1.00±0.07 1.00±0.03 1.00±0.02 1.00±0.03 ADN組 18 2.89±0.121） 2.71±0.041） 0.61±0.021） 0.54±0.041）MMF 組 19 1.23±0.081）2） 1.47±0.041）2） 0.86±0.041）2） 0.95±0.051）2）F值 2350.62 10772.77 1832.87 714.06 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

隨著人們飲食習慣的改變，加之環境因素的影響和生活工作壓力的增大，我國慢性腎病患者人群呈逐年增加的趨勢，成為威脅人類健康的主要原因之一[7]。目前普遍認為，足細胞損傷是糖尿病腎病患者主要的發病機制之一[8]。足細胞是位于腎小球基底膜外側的最后一道濾過屏障，足細胞損傷導致腎小球基底膜通透性增加，腎小球濾過率降低，從而形成蛋白尿[9]。蛋白尿是絕大多數腎臟疾病早期出現的最常見的臨床癥狀[10]。目前大多數關于NS發病機制的研究都是集中在足細胞特異性表達分子上，如Nephrin、ZO-1、Podoplanin等，尤其是Nephrin蛋白表達下調與足細胞損傷關系最為密切[11]，但是關于Nephrin蛋白的調控機制仍未明確。近幾年，隨著基因組學研究的深入及基因芯片技術的發展，越來越多的學者開始重視miRNAs在各種疾病發生、發展過程中發揮的重要作用。

miRNAs是廣泛存在于真核生物細胞中僅具有22個核苷酸長度的內源性小分子物質，與人體內1/3基因的表達密切相關，因具有特異性、高度保守性、集簇性等特點，成為多種疾病研究的新靶點[12]。同樣，也有大量miRNAs高表達于腎組織細胞，在腎臟發育和腎功能調控過程中發揮重要作用[13]。既往研究顯示，miR-200家族、miR-300家族、miR-23家族、miR-26家族都與腎組織纖維化密切相關[14]。因此，探討miRNAs與足細胞損傷的關系對于NS發病機制的研究及新藥研發具有十分重要的臨床價值。

目前，糖皮質激素一直是NS患者的首選藥物，但是對于反復發作、激素依賴性/耐藥性NS患者，臨床建議選擇免疫抑制劑治療[15]。上個世紀末才開始將MMF用于激素抵抗性或復發性NS的治療[16]。雖然降低蛋白尿的臨床療效已經得到普遍認可，但是其作用機制仍尚未明確。ADN大鼠是公認的、使用最為普遍的腎臟微小病變動物模型，關于模型復制方法，目前沒有統一標準。有文獻認為一次性注射大劑量阿霉素（≥7.5 mg/kg），雖然模型復制快，病變顯著，但是易出現嘔吐等副作用，大鼠死亡率較高[17]。而有文獻建議多次注射小劑量阿霉素（≤5 mg/kg），雖然癥狀適中，模型復制成功率較高，但是癥狀出現緩慢，模型復制周期長[18]。因此，筆者基于多年實驗經驗，選擇一次性尾靜脈注射6.5 mg/kg，大鼠生理狀況良好，死亡率低，癥狀適中。根據HE、PAS、Masson染色結果顯示，模型大鼠具備典型的急性足細胞損傷的特征，不僅出現蛋白尿，而且可觀察到腎小球肥大、系膜細胞增生、足細胞足突廣泛融合、毛細管腔狹窄、間質出現輕、中度纖維化等足細胞損傷特征。同時筆者采用TUNEL染色法，證實模型大鼠足細胞凋亡率明顯升高。但是經MMF作用28 d后，上述腎組織損傷、蛋白尿癥狀及足細胞凋亡情況都得到顯著改善。為進一步證實MMF對足細胞保護的作用機制，筆者采用基因芯片技術篩查差異性表達的miRNAs，結果顯示，與CTL組相比，ADN組有19個miRNAs表達上調，23個miRNAs表達下調。并且層次聚類圖顯示，miRNAs具有集簇分布的特點。另外，與ADN組相比，MMF組主要有7個miRNAs表達上調，有8個miRNAs表達下調。這其中都包括rnomiR-23a、rno-miR-300-3p、rno-miR-24和rno-miR-300-3c。rno-miR-23a和rno-miR-24位于19號染色體[19]，而miR-300-3p和miR-300-3c位于6號染色體[20]，因此筆者推測，19號和6號染色體的基因可能與NS發病密切相關，而且彼此在調控生物學行為過程中可能具有協同作用。為證實上述結論，本實驗進一步采取qRP-PCR檢測各組大鼠腎組織rno-miR-23a、rno-miR-300-3p、rno-miR-24和 rno-miR-300-3c的表達差異，結果與芯片結果基本一致。并且rnomiR-23a、rno-miR-300-3p、rno-miR-24和rno-miR-300-3c表達水平都與尿蛋白密切相關。以往，關于miR-23a/24/300-3p/300-3c的研究證實，這幾種基因都屬于靶向炎癥因子的重要基因，除與炎癥的發生、發展密切相關外，還參與細胞的分化、增殖等生物學行為。但是尚沒有研究關注其與足細胞損傷的關系。筆者只是初步探討miR-23a/24/300-3p/300-3c可能參與蛋白尿的生成和足細胞損傷過程，為MMF作用機制的研究提供新思路，并且為進一步藥物研究提供潛在的靶點基因，但是還需要后續研究探討具體對下游蛋白分子或信號通路的影響。

綜上所述，通過復制ADN大鼠模型，筆者證實MMF具有抑制足細胞損傷和蛋白尿生成的作用，其機制可能是對19號和6號染色體部分miRNAs有干預作用。但是本項研究只是初步分析MMF對某些重要miRNAs的影響，為NS發病機制的研究及潛在治療靶點的發現提供理論證據，仍然需要進一步研究證實miRNAs對其相應信號通路及蛋白的調控作用。