低含量含砷水暴露對子代鼠生長和發(fā)育的影響*

萬君，柯紅，王磊，洪小平，吳莉，崔潔

[1.三峽大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院（葛洲壩集團中心醫(yī)院） 藥學(xué)部，湖北 宜昌 443002；2. 三峽大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院（葛洲壩集團中心醫(yī)院） 腫瘤科，湖北 宜昌 443002；3.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)部，湖北 宜昌 443002]

流行病學(xué)研究表明，砷暴露與不良生殖/發(fā)育結(jié)果有關(guān)[1]。此外，妊娠時砷暴露引起胎鼠出生體重、存活率降低，自發(fā)性流產(chǎn)等發(fā)病率升高，但是砷暴露引起人類疾病發(fā)生的機制尚不清楚[1-2]。由于存在致癌風(fēng)險，目前我國《生活飲用水衛(wèi)生標準》（GB 5749-2006）已將砷限值提高至≤ 10μg/L（10 ppb）[3]。但目前GB 5749-2006標準中的低劑量砷對孕婦和嬰兒等易感人群的影響尚無共識[4]。本研究復(fù)制早期砷暴露小鼠模型，旨在觀察發(fā)育關(guān)鍵期低水平砷暴露對小鼠生長、發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

C57BL/6J小鼠購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司，交配前2周采用AIN-76A飼料喂養(yǎng)小鼠。檢測到小鼠交配受孕后，給予潔凈水（對照組）或10 ppb砷水（砷暴露組）飼養(yǎng)小鼠，直至其完成妊娠和哺乳，雄性小鼠交配前未暴露于砷。分娩后，砷暴露組母鼠進一步分為3組：①出生后砷暴露組（A組，子代鼠出生后1～30 d暴露于10 ppb砷飲用水）；②子宮內(nèi)砷暴露組（B組，子代鼠出生前暴露于10 ppb砷飲用水）；③子宮內(nèi)和出生后砷暴露組（C組，子代鼠出生前至出生后30 d內(nèi)暴露于10 ppb砷飲用水）。從妊娠第18天開始，監(jiān)測2次/d，密切觀察母鼠分娩情況。子代鼠出生后第22天斷奶，并根據(jù)分組飲用潔凈水或10μg/L砷水。妊娠期第15.5天或哺乳期間不同時間點處死部分母鼠，進行尸檢；產(chǎn)后第10、22和42天處死部分子代鼠，進行尸檢。將各組部分（3～6只）小鼠置于代謝籠飼養(yǎng)24 h，在指定時間點收集尿液，并測定飲用水?dāng)z入量。

1.2 砷暴露

將亞砷酸鈉溶于滅菌雙蒸水配制成10 ppb濃度的飲用水。采用高效液相色譜儀檢測最終溶液中的砷濃度，飲用水更換2次/周。

1.3 記錄子代鼠生長情況

母鼠分娩時，記錄幼崽長度、幼崽數(shù)量、平均幼崽重量（平均幼崽重量=所有幼崽總重/幼崽數(shù)）、死亡幼崽數(shù)和畸形幼崽數(shù)。產(chǎn)后記錄子代鼠重量（g）至 28 d。

1.4 肝臟組織HE染色

不同時間點處死母鼠和子代鼠后，游離肝臟，用甲醛（上海國藥集團化學(xué)有限公司）固定后，石蠟包埋切片，行HE染色（武漢博士得公司）。

1.5 蛋白質(zhì)濃度測定

產(chǎn)后10～12 d，將母鼠與幼鼠分離6 h使母乳積聚。按照0.1 ml/30 g體重的比例，肌內(nèi)注射氯胺酮-甲苯噻嗪混合物（9∶1）麻醉母鼠，同時注射1 ml催產(chǎn)素。通過手刺激小鼠乳頭擠奶，用移液管收集。母乳儲存于-20℃冰箱備用。母乳用PBS稀釋，采用二喹啉甲酸蛋白含量測定試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）測定母乳中蛋白質(zhì)濃度。

1.6 三酰甘油的檢測

采用自動生化儀（日本奧林巴斯公司）測定母鼠母乳（1∶160稀釋）、肝組織勻漿（1∶20稀釋）和血清（1 ∶ 2 稀釋）中甘油三酯（Triglyceride, TG）的濃度。

1.7 電感耦合等離子體質(zhì)譜分析

采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）（德國西門子公司）測量母乳（5只）、幼崽胃部（6只）、母鼠尿（3只）和胎盤（3只）中微量金屬總濃度。胎盤、胃和母乳樣品在70℃條件下用0.3～0.5 ml最適HNO3消化，然后加入0.05～0.10 ml雙氧水H2O2，并將消化樣品稀釋至3 ml（胃和母乳）或5 ml（胎盤）終體積。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以率表示，比較用Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分娩結(jié)果

對照組產(chǎn)仔數(shù)（7.5±0.3）只，砷暴露組（7.4±0.3）只，經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.341，P=0.336）。對照組孕齡（20.2±0.3）d，砷暴露組（19.6±0.4）d，經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.942，P=0.573）。對照組幼崽（包括存活和死亡）平均重量（1.28±0.01）g，砷暴露組（1.26±0.02）g，經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.963，P=0.566）。以上研究結(jié)果提示，對照組和砷暴露組分娩結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 子代鼠生長情況

出生后第10天對照組及A、B、C組小鼠體重分 別 為（5.33±1.82）、（3.54±0.93）、（3.82±1.04）和（4.01±1.16）g，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=58.782，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，A、B、C組子代鼠體重均低于對照組（P＜0.05）；而A、B、C組間子代鼠體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明出生后第10天砷暴露組（A、B、C組）子代鼠生長減緩。見圖1。

出生后第22天（斷奶時）對照組及A、B、C組小鼠體重分別為（10.84±1.32）、（7.01±1.14）、（8.23±1.35）和（7.28±1.17）g，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=973.614，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，A、B、C組子代鼠體重均低于對照組（P＜0.05），而A、B、C組間子代鼠體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明出生后22天砷暴露組（A、B、C組）子代鼠生長減緩。見圖1。

圖1 砷暴露對子代鼠生長發(fā)育的影響 （±s）

2.3 胎盤、母乳、幼崽胃和尿砷濃度比較

砷暴露組胎盤、母乳和幼崽胃砷含量接近檢出限值。對照組未受孕小鼠尿砷含量（11.5±5.2）μg/L，暴露組（56.0±13.1）μg/L，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.913，P=0.000）（見圖 2）。

受孕第15.5天時，B組胎盤砷含量（1.2±0.4）ng/g，對照組（1.0±0.5）ng/g，經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.974，P=0.351）（見圖 3A）。受孕第 15.5天時，B組母鼠尿砷含量（26.7±6.9）μg/L，對照組（6.9±2.5）μg/L，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.715，P=0.000），B 組母鼠尿砷含量高于對照組（見圖3B）。

出生后第10天，對照組及A、B、C組幼崽胃砷 含 量 分 別 為（0.6±0.3）、（2.1±0.5）、（0.9±0.4）及（2.7±1.0）ng/g，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=15.412，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng) LSD-t檢驗，A、C組幼崽胃砷含量高于對照組（P＜0.05）（見圖4A）。對照組及A、B、C組母乳砷含量分別為（1.66±0.7）、（1.72±0.43）、（1.58±0.34） 及（1.62±0.57）ng/g，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.444，P=0.971）（見圖 4B）。出生后第 10天，對照組及A、B、C組母鼠尿砷含量分別為（4.83±1.12）、（6.13±1.37）、（18.24±2.82）、（19.33±1.97）μg/L，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=137.641，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，B、C組母鼠尿砷含量高于對照組（P＜0.05）（見圖 4C）。出生后第22天，對照組及A、B、C組幼崽胃砷含量分 別 為（4.72±1.34）、（5.14±1.28）、（4.83±1.08）、（4.58±0.94）ng/g，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.197，P=0.882）（見圖 4D）。

圖2 對照組與砷暴露組未受孕小鼠尿砷含量比較 （±s）

2.4 母乳營養(yǎng)物質(zhì)改變

母乳喂養(yǎng)的砷暴露組幼崽體重在出生后早期（出生后前10天）增加不明顯，出現(xiàn)生長缺陷，可能與母乳成分改變有關(guān)。4組母乳總蛋白含量比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。4組母乳TG比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，砷暴露組母乳TG濃度低于對照組（P＜0.05）。見附表。

2.5 砷對母鼠和子代鼠肝臟脂肪變性的影響

妊娠第15.5天時，砷暴露組母鼠脂肪肝發(fā)生率為55.5%（5/9），對照組母鼠為0.0%（0/9），經(jīng)Fisher確切概率法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.029），砷暴露組脂肪肝發(fā)生率高于對照組。肝脂肪變性經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診（見圖5A、B）。所有暴露組小鼠出生后第22天時未觀察到肝脂肪變性，表明砷對肝的影響是暫時的（見圖5C、D）。

圖3 對照組與B組子鼠受孕第15.5天砷含量比較 （±s）

圖4 母鼠和子代鼠不同組織樣本的砷含量比較 （±s）

圖5 孕期砷暴露對母鼠肝臟脂肪變性的影響 （HE×200）

附表 低水平砷暴露對母乳營養(yǎng)成分的影響（n =5，mg/ml，±s）

附表 低水平砷暴露對母乳營養(yǎng)成分的影響（n =5，mg/ml，±s）

注：?與對照組比較，P＜0.05

組別 總蛋白 TG對照組 203.4±16.7 6 247±118 A 組 218.3±12.6 2 893±109?B 組 209.8±11.3 3 047±114?C 組 216.4±13.4 2 678±273?F值 2.475 24.928 P值 0.077 0.000

3 討論

本研究表明，宮內(nèi)接觸我國飲用水最高標準量的砷暴露對母鼠和子代鼠的影響時間極為短暫，主要影響包括子代鼠生長減緩、母鼠TG水平和成分改變、母乳營養(yǎng)物質(zhì)降低（特別是TGs）等。與對照組相比，砷暴露組胎盤砷水平未增加，可能是因為砷暴露組的砷可大量通過胎盤轉(zhuǎn)移，但該動物模型使用砷水平較低，ICP-MS的檢出范圍有限，影響了砷的檢測值。人體暴露模型和高劑量砷暴露小鼠模型研究證實砷通過胎盤轉(zhuǎn)移[5]。本研究還觀察到所有砷暴露組中，攝入相同水平的砷，母體在妊娠期和產(chǎn)后期排泄的砷較未受孕小鼠減少。最近流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，妊娠可以顯著改變砷代謝，因為小鼠對砷的新陳代謝非常高效[6-8]。本研究結(jié)果顯示，妊娠期小鼠尿中砷含量可能不是飲用水砷暴露水平的準確標志。

與預(yù)期不同的是，本研究發(fā)現(xiàn)低劑量砷暴露影響子代鼠生長發(fā)育。既往研究表明，高劑量砷暴露大鼠模型[10、50和100 mg/L]影響子代鼠生長發(fā)育，而ppb和ppm級砷水平暴露并未影響子代鼠早期體重變化[9-11]。本研究還發(fā)現(xiàn)這些影響是暫時的，可以通過干預(yù)加以改善，表明本實驗和其他研究相似的模型暴露時間和實驗終點的不同會影響觀察結(jié)果。此外，本研究并未發(fā)現(xiàn)合并暴露期（即宮內(nèi)+產(chǎn)后）比單一暴露期（宮內(nèi)或產(chǎn)后）的影響更大，因此，本研究結(jié)果并不能排除小鼠對低劑量砷暴露可能存在一定的適應(yīng)能力。根據(jù)本研究結(jié)果，砷能夠引起子代鼠生長發(fā)育缺陷，其原因可能與母鼠乳汁營養(yǎng)成分改變有關(guān)。然而，本實驗不能明確排除母體一些行為的改變在幼崽培育過程中不會引起生長缺陷。本研究結(jié)果表明，砷暴露會對母乳成分和質(zhì)量產(chǎn)生影響，即使砷沒有直接通過母乳分泌和轉(zhuǎn)移。既往研究報道，成年小鼠在亞致死性流感和砷綜合暴露下，可增加呼吸道感染的嚴重程度[12]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)砷暴露母乳有脂蛋白的改變和肝臟的脂肪變性。

總之，本研究表明，宮內(nèi)或產(chǎn)后低水平砷暴露會產(chǎn)生許多直接的不利影響，包括TG和脂質(zhì)水平改變，子代鼠生長缺陷，提示影響砷暴露易感人群的砷水平可能低于目前飲用水最高標準（10 ppb）。