粘質(zhì)沙雷氏菌S823次生代謝產(chǎn)物及其抗腫瘤活性研究

朱琳妍，龐翠萍，朱向東，陳鯉群*

1福州大學生物科學與工程學院，福州 350116；2江南大學生物工程學院，無錫 214122； 3江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院，南昌 330045

甾體化合物通過微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了新的產(chǎn)物，表現(xiàn)出抗腫瘤、抗菌等活性。匍匐根霉產(chǎn)生的孕烯醇酮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對酪氨酸酶和膽堿酯酶的抑制活性明顯高于母化合物[1]。1943年Turfitt[2,3]發(fā)現(xiàn)微生物能夠降解膽固醇并生成C-19的甾體激素。利用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)能夠得到前體所不具有的新特性化合物[4-6]。微生物的次生代謝產(chǎn)物也是抗腫瘤、抗菌等多種生物活性成分的來源。這些次生代謝產(chǎn)物具有重大的藥用價值，引起學者們強烈興趣。一些學者從沙雷氏屬和鏈霉菌屬細菌中分離到由3個吡咯環(huán)形成一個大的共軛體系構(gòu)成分子骨架的抗菌活性成分[7,8]，由Serratiamarcescens產(chǎn)生的Prodigiosin能抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[9]，Undecylprodiginine及其合成的衍生物23-hydroxyundecylprodiginine和2-ketoundecylprodiginine具有強烈抗瘧原蟲作用[10]，以及從鏈霉菌屬和沙雷氏屬一些菌中分離出的Prodigiosin 25-C有免疫[11]和抗腫瘤活性[12]。

我們以膽固醇為唯一碳源篩選到一株菌株，該菌株能將膽固醇轉(zhuǎn)化為7β-羥基膽固醇(7β-HC)，目前沒有文獻報道。在此基礎(chǔ)上，我們發(fā)現(xiàn)該菌提取物對Neuro-2a細胞(小鼠神經(jīng)瘤細胞)有抑制作用，通過活性追蹤，分離到活性成分靈菌紅素，發(fā)現(xiàn)靈菌紅素對細胞周期分裂蛋白25B (CDC25B)和含SH2結(jié)構(gòu)域蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)這2個靶標蛋白具有強的抑制活性。SHP2的表達可以抑制腫瘤細胞的生長，此項研究在快速有效分離微生物中抗腫瘤活性成分方面是一種創(chuàng)新。大部分的SHP2細胞是通過靠近細胞膜促進酪氨酸的磷酸化而影響細胞生長，這些重要結(jié)論有助于抗腫瘤藥物篩選，SHP2是潛在的靶分子。CDC25B在分裂的M和G1期存在于細胞核中，而到S期和G2期轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中，CDC25B具有原癌基因性質(zhì)，尋找到特異高效的抑制劑對癌癥研究提供新的工具和手段。靈菌紅素抑制Neuro-2a細胞(小鼠神經(jīng)瘤細胞)的IC50值是0.05μM，此項研究為微生物資源利用，以及抗腫瘤藥物研發(fā)提供科學依據(jù)。

1 儀器和材料

1.1 菌種來源

土樣：采用同一地區(qū)多點取樣，于2016年5月取自云南省昆明市市郊玉米田間紅壤土。

菌種：以膽固醇為唯一碳源篩選得到。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(g/L)：土豆200、葡萄糖20、酵母膏3，pH7.0。

篩選培養(yǎng)基(g/L)：膽固醇0.5+吐溫80、MgSO40.25、K2HPO40.25、FeSO4·7H2O 0.001、NaCl 0.05、CaCl20.001、瓊脂粉15，pH7.0。

斜面培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3、蛋白胨10、NaCl 5、瓊脂粉15，pH7.0。

種子液培養(yǎng)基(BPDAg/L)：牛肉膏3、蛋白胨10、NaCl 5，pH7.0。

轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏5、MgSO40.25、K2HPO40.25、FeSO4·7H2O 0.001、NaCl 0.05，CaCl20.001，pH7.0。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(BPDAg/L)：牛肉膏3、蛋白胨10、NaCl 5，pH7。

1.3 供試細胞

Neuro-2a細胞(小鼠神經(jīng)瘤細胞)，來自江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院細胞生物學實驗室所保存的細胞株。

1.4 試劑

膽固醇、氯仿、甲醇、石油醚、丙酮(國藥集團)；GF245硅膠層析板(青島海洋化工有限公司)；Sephadex LH20(Pharmacia公司，美國)。

胎牛血清(杭州四季青)；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、DMSO、MTT，PBS磷酸緩沖液干粉、DMEM高糖培養(yǎng)(北京索萊寶公司)。

1.5 儀器

PCR反應擴增儀(BBI公司，加拿大);高效液相色譜儀，Waters Symmetry C18色譜柱( 150 mm × 4.6 mm，5.0 m) (waters公司，美國)；Agilent G6220A質(zhì)譜儀(Agilent,美國);Avance 600核磁共振儀(Bruker公司，瑞士)，RT-6000酶標儀(深圳雷杜)

2 實驗方法

2.1 菌種初篩

取1 g土樣放入裝有50 mL已滅菌無菌水的三角瓶中，置于搖床振蕩半小時，取土樣水溶液1 mL于富集培養(yǎng)基中，28～30 ℃、180 rpm的搖床中培養(yǎng)24 h，從富集培養(yǎng)基中取200 μL加入到50 mL液體篩選培養(yǎng)基中，180 rpm 、30 ℃震蕩培養(yǎng)48 h，共進行3次轉(zhuǎn)移培養(yǎng)，然后取100 μL稀釋度為10-6的菌液涂布于以膽固醇為唯一碳源的固體篩選培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)。菌落長出后根據(jù)形態(tài)挑取單菌落，在篩選培養(yǎng)基上純化兩次后將菌株轉(zhuǎn)移至斜面上培養(yǎng)，編號并保藏。

2.2 復篩

將初篩得到的菌種接種于裝有50 mL已滅菌發(fā)酵液的250 mL三角瓶中，180 rpm,28～30 ℃、搖床培養(yǎng)24 h后投入20 mL 0.5 g/L的膽固醇吐溫80乳化液，相同條件下繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)4～7天。發(fā)酵液離心或過濾并用氯仿萃取，萃取液濃縮到一定體積，用硅膠板作薄層層析(TLC)進行檢測分析，根據(jù)檢測結(jié)果，篩選出具有轉(zhuǎn)化膽固醇能力的菌株。

2.3 膽固醇轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離

轉(zhuǎn)化發(fā)酵液離心后，將上清液與菌體分開，上清液濃縮至一定體積后用等體積氯仿反復萃取3次，然后用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50 ℃濃縮，用少量硅膠拌樣，干燥后用100 g 200～300目硅膠裝柱，用甲醇：氯仿=0～25%洗脫，每30 mL收集一流份，根據(jù)TLC檢測。對含轉(zhuǎn)化產(chǎn)物用Sephadex LH-20進行凝膠色譜，甲醇∶氯仿= 1∶1洗脫，再用Rp-C18反相色譜，水：甲醇=30∶70%～95∶5%洗脫，產(chǎn)物經(jīng)波譜鑒定。

2.4 抑制腫瘤細胞活性檢測

采用MTT法以Neuro-2a細胞(小鼠神經(jīng)瘤細胞)作為供試細胞，通過對洗脫流份抗腫瘤活性檢測，對含活性成的樣品進行色譜分離，對分離到的活性化合物測定IC50值。

取在培養(yǎng)瓶中貼壁生長狀態(tài)良好的細胞，棄去廢培養(yǎng)基，每瓶加入PBS磷酸緩沖液，洗滌一遍棄去，除去衰老的細胞，每瓶(25 cm2)加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化，觀察到培養(yǎng)瓶貼壁面有呈塊細胞離散開來，棄去消化酶液，加入一定量的10%胎牛血清培養(yǎng)基配成3×104的細胞混懸液，接種于96孔板，每孔100 μL細胞懸液，(注意孔板周圍一圈孔不加，而用PBS填充)，待到細胞長到80%，棄去原來的培養(yǎng)基，加入供試樣品溶液，濃度為80 μg/mL，每孔100 μL，同時用完全培養(yǎng)基作為空白對照，陽性參照化合物為阿霉素，溶劑對照(DMSO的濃度與最高濃度實驗組中的DMSO的含量相當)，每個實驗組設(shè)立3個平行，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，加入100 μL 10%MTT的完全培養(yǎng)基，作用4 h，移去上清液，加入150 μL DMSO,搖床震蕩30 min，待甲簪產(chǎn)物完全溶解后，用酶標儀在490 nm條件下測定OD值。根據(jù)公式(1)計算各組濃度組的細胞增殖抑制率：

細胞增殖抑制率=1-(OD實驗組-OD空白對照組)/(OD溶劑對照組-OD空白對照組) ×100%

IC50值計算，根據(jù)測試活性劑量依賴關(guān)系，設(shè)5個濃度梯度，1、10、20、30、40 μg/mL，通過樣品活性對樣品濃度進行非線性擬和得到，計算所用軟件為Graphpad Prism 4，擬合所使用的模型為Sigmoidal dose-response (varible slope)。

2.5 抗腫瘤活性成分分離

經(jīng)過48 h發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液合計2 L，經(jīng)過離心去除上清液后，菌體用丙酮超聲波進行浸提20 min，反復浸提3次，過濾，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50 ℃下濃縮得浸膏，用氯仿溶解，用適量硅膠拌樣，干燥后進行硅膠柱層析，根據(jù)TLC檢測,合并有相同組分的流份，以Neuro-2a細胞作為供試細胞，對洗脫流份進行抗腫瘤活性檢測。上清液用氯仿萃取、濃縮后，得到的固體物質(zhì)量很少，未做進一步實驗。

2.6 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和抗菌活性成分的結(jié)構(gòu)鑒定

分離純化的產(chǎn)物采用質(zhì)譜和核磁共振波譜進行測定，溶劑為氘代氯仿，TMS作為內(nèi)標。

2.7 菌種鑒定

2.7.1 形態(tài)及生理生化測定

通過形態(tài)學觀察菌株在斜面培養(yǎng)基及篩選培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，電鏡觀察細胞形態(tài)，對菌株進行相關(guān)生理生化實驗，參照東秀珠等編著的《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]進行鑒定。

2.7.2 16S rDNA基因的克隆與測序

①基因組的提取：利用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司的Ezup 柱式細菌基因組 DNA 抽提試劑盒進行提取。

②以primerA (5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′) primerB(5′- GGTTACCTTGTTACGA CTT-3′)為上下游引物擴增菌株的16S rDNA。PCR反應體系(25 μL)：0.5 μL Template (基因組 DNA 20～50 ng/μL)，0.5 μL PrimerA(10 uM)，0.5 μL PrimerB(10 uM)，1 μL dNTP mix (2.5 Mm each)，2.5 μL 10×Buffer(with Mg2+)，0.2 μL 酶(5 u/μL)，加水至25 uL。反應條件：預變性94 °C 4 min，循環(huán)94 °C 45 s，55 °C 45 S，72 °C 1 min，30個循環(huán)，延伸10 min。擴增的16S rDNA純化后由上海生工有限公司直接測序。

③將序列上傳到GenBank中進行比對，調(diào)取沙雷氏菌屬(Serratia)12個標準菌株的16S rDNA序列，進行系統(tǒng)發(fā)育學分析。16S rDNA 序列用MEGA( 6.0) 軟件排序，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用Kimura2-Parameter Distance模型計算進化距離，計算自引導值( Bootstrap，1 000次重復) 以評估系統(tǒng)發(fā)育樹的置信度。

2.8 提取物抑制細胞周期分裂蛋白25B和含SH2結(jié)構(gòu)域蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)活性測定

采用熒光底物OMFP，經(jīng)CDC25B去磷酸化后得到的產(chǎn)物OMF在被485 nm激發(fā)光激發(fā)后可發(fā)射出波長為530 nm的可檢測的熒光信號，從而觀察酶的活性變化，以及化合物對其的抑制情況。陽性參照化合物為Na3VO4。

3 結(jié)果與分析

3.1 篩選結(jié)果

復篩得到16株呈深紅色、圓形光滑形態(tài)的菌株，挑選一株，經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)，離心后上清液用氯仿萃取，并用硅膠板薄層層析法( TLC) 檢測，展開劑為石油醚∶丙酮= 7∶3( v/v)，用10%的H2SO4乙醇溶液作為顯色劑。 樣品用上述展開劑展開，噴霧、加熱顯色。發(fā)現(xiàn)這些菌株都能夠轉(zhuǎn)化膽固醇。其中一株菌，經(jīng)上述實驗，結(jié)果如圖1。

圖1 菌株發(fā)酵轉(zhuǎn)化產(chǎn)物TLC檢測Fig.1 TLC of strain of transformation注：1.接菌種的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液；2.未接菌種的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液；3.膽醇固標準品(A)；4.分離純化的7β-羥基膽固醇(B)。Note:Lane 1 is the bioconversion medium with inoculated strain;Lane 2 is the bioconversion medium without inoculated strain;Lane 3 is cholesterol(A);Lane 4 is 7β-dydroxycholesterol(B) separated from the extract of the strain S823.

3.2 菌株鑒定

3.2.1 菌落形態(tài)特征

菌株S828為革蘭氏陰性短桿菌，電鏡顯示大小約大小為(1～1.3)μm×(0.7～1.0)μm，如圖2所示,無莢膜，無芽孢，周生鞭毛。30 ℃在平板上培養(yǎng)36 h，菌落凸起，呈圓形光滑狀，濕潤，中心不透明，邊緣整齊，深紅色，易挑取，培養(yǎng)時間超過72 h，菌落易成樹枝狀，邊緣不規(guī)則。在液體培養(yǎng)基中混濁，形成菌膜，在篩選平板上呈粉紅色不透明菌落。

圖2 菌株S823的電鏡圖Fig.2 Scanning electron micrograph of isolate S823

3.2.2 生理生化實驗

通過部分的生理生化試驗(表1)，結(jié)果顯示菌株S823與粘質(zhì)沙雷氏菌非常相似。

表1 菌株S823的生理生化特征

續(xù)表1(Continued Tab.1)

項目Item標準反應Standard reaction結(jié)果Result項目Item標準反應Standard reaction結(jié)果ResultKNO3利用Use of KNO3 --(NH4)2HPO4利用Use of (NH4)2HPO4-+

注：“+”90%以上菌株陽性，“-”90%以上菌株陰性， “D”不同分類單位中的反應不同。

Note:“+”over 90% showing the positive bacteria strains;“-” over 90% showing the negative bacteria strains;D represent the different reaction in the different taxonomic unit.

3.2.3 16S rDNA鑒定

16S rDNA測序結(jié)果表明，16S rDNA序列有1434個堿基(如下)，在Genebank中進行比對分析，并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3，確定該菌株為粘質(zhì)沙雷氏菌屬，并命名為Serratiamarcescenssp.S823，上傳序列號為KR817904.1。

圖3 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S r RNA sequences of selected strains.Numbers in parentheses represent the sequences paccession number in GenBank.The number at each branch points is the percentage supported by boot strap.Bar,0.5% sequence divergence

3.3 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分離

轉(zhuǎn)化發(fā)酵液合計1 L，離心后，上清液濃縮至一定體積后，用等體積氯仿反復萃取3次，合并萃取液，真空濃縮，經(jīng)硅膠柱、凝膠柱、反相柱色譜進行分離，得到了化合物1，稱重83 mg。

3.4 抗腫瘤活性物質(zhì)的分離

經(jīng)過48 h發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液合計2 L，離心后，菌體用丙酮超聲波進行浸提、濃縮得浸膏，用氯仿溶解，用適量硅膠拌樣，干燥后用200克200～300目硅膠裝柱(5×80)，氯仿：甲醇=100∶0～70∶30洗脫，每瓶收集50 mL，共22個流份，根據(jù)TLC檢測，展開劑為石油醚∶丙酮= 7∶3(v/v)，10%的H2SO4乙醇溶液作為顯色劑。 樣品展開后，噴霧、加熱顯色。合并有相同組分的流份，得到7個部分F1-F7，濃縮干燥后用DMSO溶解，用蒸餾水配成80 μg/mL溶液，DMSO在最終體系中濃度控制在不影響檢測活性的范圍之內(nèi)。經(jīng)抑制腫瘤實驗，F(xiàn)3顯示了對Neuro-2a細胞有抑制作用(圖4)。 TLC顯示，F(xiàn)3只有一個紅點,這表明F3可能是一個純的化合物，其純度用HPLC進行檢測。F3真空干燥后，得到了化合物2，稱重62 mg。準確稱取化合物2樣品3.6 mg用乙腈定容至10 mL，配制成0.36 mg/mL的溶液，取10 μL溶液進樣進行HPLC測定。分析條件如下：色譜柱：Waters Symmetry C18色譜柱( 150 mm × 4.6 mm，5.0 m)：溫度：35 ℃；流速：0.45 mL/min；檢測：RI2000示差檢測器；流動相A：乙腈=10%，流動相B：水=90%。出峰時間為8.931 min，其峰面積比接近99%，說明其純度達到99%(圖4)。F1- F2和F4-F7對Neuro-2a細胞沒有抑制作用,沒有進一步分離。

圖4 菌株S823提取物柱層析洗脫組份對Neuro-2a細胞的抑制率(A)和F3(化合物2)HPLC圖(B)Fig.4 The inhibition rate of different parts of the extract of the strain S825 against Neuro-2a cell (A) and the HPLC spectrum of F3 (compound 2)(B)

2.5 化合物鑒定

化合物1無色固體;1H NMR(CDCl3，600 MHz),δ:0.69(s，3H)、0.86(d，3H，J=2.4)、0.87(d，3H，J=3.0)、0.93(d，3H，J=6.6)、1.05(s，3H)，δ5.28(1H，s，H-6)，δ3.54(m，1H，3-βOH)，3.84(d，1H，7-βOH);13C NMR (CDCl3,150MHz)δ:36.9 (t,C-1),31.6 (s,C-2),71.4 (d,C-3),41.7 (t,C-4),143.5 (s,C-5),125.5(d,C-6),73.4 (d,C-7),40.9 (d,C-8),48.3 (d,C-9),36.4 (d,C-10),21.1 (t,C-11),28.6 (t,C-12),42.9 (s,C-13),55.4 (d,C-14),26.4 (t,C-15),39.6 (t,C-16),54.9(d,C-17),11.8 (q,C-18),19.2 (q,C-19)，35.7(d,C-20),18.7 (q,C-21),36.2 (t,C-22),23.9(t,C-23),39.5 (t,C-24),28.0 (d,C-25),22.6 (q,C-26),22.8(q,C-27)。數(shù)據(jù)與文獻中的報道基本一致[14]，由此，可判斷該化合物為7β-羥基膽甾醇(7β-hydroxycholesterol,7β-HC)。

化合物2紅色固體;UV (MeOH)λmax 535;1H NMR (CDCl3,600 MHz),δ:12.55 (s,NH),12.70 (s,NH),7.22 (s,1H,H-2),6.35 (t,J=1.8 Hz,1H,H-3),6.91 (m,1H,H-4),6.08 (d,J=1.8 Hz,1H,H-8),6.94 (m,1H,H-12),6.67 (s,1H,H-14),4.00 (s,3H,O-Me),2.38(t,2H,H-18),2.54 (s,3H,H-15),1.2- 1.4 (m,6H.H-19-21),0.89 (t,3H,H-22);13C NMR (CDCl3,150 MHz),δ:126.9(C-2),111.7(C-3),117.0(C-4),122.2(C-5),147.7(C-7),92.8(C-8),165.5(C-9),120.7(C-10),

58.7(C-1),116.0(C-12),125.1(C-13),128.5(C-14),128.5(C-15),147.0(C-16),12.4(C-17),25.3(C-18),29.8(C-19),30.6 (C-20),22.5(C-21)，14.1(C-22);ESI-MS:m/z324.3[M+H]+( C20H25N3O)。數(shù)據(jù)與文獻報道的靈菌紅素(prodigiosin)一致[15]，確定為靈菌紅素，結(jié)構(gòu)為(5[(3-methoxy-5-pyrrol -2- ylidene-pyrrol -2- ylidene) -methyl] -2- methyl- 3-pentyl-1 H pyrrole) (見圖5)。

圖5 底物、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和次生代謝活性產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式Fig.5 Structures of substrate and biotransformation product and activity compound注：化合物A：膽甾醇，B：7β-羥基膽甾醇，C：靈菌紅素。Note:Compound A,Cholesterol;B,7-β-hydroxycholesterol;C,prodigiosin.

3.6 靈菌紅素抑制CDC25B和SHP2活性測定

實驗以Na3VO4作為對照樣品，實驗結(jié)果顯示，靈菌紅素對細胞周期分裂蛋白25B(CDC25B)和含SH2結(jié)構(gòu)域蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)有抑制活性，而7β-羥基膽甾醇對這2個靶標蛋白沒有抑制活性(表2)。

表2 活性化合物對CDC25B和SHP2的抑制

3.7 抑制腫瘤細胞IC50值測定

以Neuro-2a細胞作為供試細胞，根據(jù)測試活性劑量依賴關(guān)系，測定了靈菌紅素5個濃度梯度，1、10、20、30、40 μg/mL對Neuro-2a細胞的抑制率分別為29.9%、41.9%、55.2%、68.5%、81.8%，通過樣品活性對樣品濃度進行非線性擬和得到，測得IC50為0.05 μmol/L。

4 結(jié)論

在本研究中，我們通過微生物轉(zhuǎn)化，首次用篩選的粘質(zhì)沙雷氏菌轉(zhuǎn)化得到7β-羥基膽甾醇，此化合物有重要的生物活性，其對體外培養(yǎng)的增殖分化的細胞及腫瘤細胞具有細胞毒性作用，誘導細胞凋亡，而對非增生的、緩慢分裂的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞，沒有毒性作用[16]。并從該菌中分離得到靈菌紅素，此代謝產(chǎn)物對細胞周期分裂蛋白25B (CDC25B)和含SH2結(jié)構(gòu)域蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)有強的抑制活性，這是我們首次報道靈菌紅素對這兩種靶標有抑制作用。靈菌紅素廣泛的生物活性，包括抗菌活性[9]、抗瘧疾活性[10,17]、免疫抑制活性[11,18]，以及抗腫瘤活性[19,20]激發(fā)國內(nèi)外學者強烈興趣。一些學者對不同環(huán)境產(chǎn)靈菌紅素菌株篩選[9]、靈菌紅素的合成和結(jié)構(gòu)進行了研究[20]。這些研究成果可為開發(fā)利用微生物，研制抗腫瘤藥物提供科學依據(jù)。