荷葉總生物堿激活肝臟AMPK/Nrf2通路緩解對乙酰氨基酚誘導的小鼠急性肝損傷

舒廣文，邱韻涵，李 薇，付 千，諶業珺，鄧旭坤

中南民族大學藥學院 民族藥學國家級實驗教學示范中心，武漢 430074

對乙酰氨基酚(Acetaminophen，APAP)是一種廣泛使用的解熱鎮痛藥[1]。但是，在攝入過量時，APAP可誘發肝臟氧化應激，從而引起嚴重的肝損傷，并可進一步惡化為致命的肝衰竭[2]。目前，臨床上主要采取抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸來應對APAP誘導的肝損傷。但是，其治療效果并不十分令人滿意[3]。因此，尋找潛在的能夠緩解APAP所致肝損傷的新藥具有十分重要的意義。

Nrf2(NF-E2-related factor-2)是一個廣泛表達于高等動物各個組織內的轉錄因子，它可與其下游基因啟動子區域內的特定順式作用原件——抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)直接結合并啟動基因的轉錄[4]。對Nrf2蛋白亞細胞定位的調節是Nrf2通路活性調控的經典方式。在細胞不受任何刺激的狀態下，Nrf2蛋白將與其抑制因子Keap1蛋白結合而定位于細胞質基質中[5]。這時，Nrf2不能發揮其轉錄激活作用。當細胞內發生氧化應激時，Keap1的構象發生改變。這時，Keap1與Nrf2的結合能力降低，Nrf2可從Keap1上釋放出來，進入細胞核并啟動其下游基因的轉錄[6]。典型的受Nrf2控制的下游基因包括血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)和谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(catalytic subunit of glutamate cysteine ligase，GCLC)等抗氧化酶的編碼基因。這些基因的表達產物能夠對抗環境中或者內源性的各種毒性物質誘導的細胞內氧化應激。研究表明，增強 Nrf2 通路活性可明顯緩解APAP誘導的肝損傷[7]。因此，靶向性激活Nrf2通路可作為干預APAP所致肝損傷的潛在策略。

很多植物來源的天然產物對毒物誘導的肝損傷都有較好的干預作用[8,9]。荷葉是睡蓮科植物蓮的干燥葉，含黃酮、生物堿、皂苷等多種化學成分，藥理活性廣泛[10]。研究表明，荷葉中的生物堿類化合物具有良好的抗氧化作用[11]。然而，目前尚不清楚荷葉總生物堿(total alkaloids from lotus leaves，TAL)是否可以緩解APAP所致的急性肝損傷。因此，本實驗探討了TAL對APAP所致小鼠急性肝損傷的保護作用和可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

動物：雄性8周齡昆明小鼠，體重20～25 g，由湖北省實驗動物研究中心提供。實驗動物生產許可證號：SCXX(鄂)2015-0018。

主要試劑與試劑盒：APAP(批號B19M8E36136，質量分數>98%)，購自上海源葉生物科技有限公司；識別NF-E2-related factor-2(Nrf2)、Lamin B、heme oxygenase-1(HO-1)、catalytic subunit of glutamate-cysteine ligase(GCLC)和β-actin蛋白的一抗和酶標二抗購自武漢三鷹生物技術有限公司；識別AMPKα(α subunit of AMP-activated protein kinase)和172位蘇氨酸磷酸化的AMPKα的一抗購自碧云天生物技術有限公司。ALT、AST、MDA、GSH、SOD、CAT、GSH-Px試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-1β和IL-6 的ELISA檢測試劑盒購自南京建成生物技術研究所。細胞核提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

主要儀器：THERMO Multiskan GO酶標儀，美國Thermo Scientific公司；7300熒光定量PCR儀，美國ABI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 TAL的制備

TAL的制備參照已有文獻[12]。取干燥的荷葉(100 g)，粉碎過篩，以30倍體積的0.2% HCl為溶劑進行提取，提取3次，每次持續3 h。合并提取液，過濾，將濾液濃縮至一定體積后過D001陽離子交換樹脂柱。然后，先以5倍柱體積的純化水洗滌去除雜質，再以含1%氨水的95%乙醇溶液洗脫。將洗脫液濃縮蒸干，即得TAL(0.92 g)。

1.2.2 動物分組與造模

在參考過相關文獻[13,14]并進行預實驗之后，我們選擇30和100 mg/kg作為TAL的給藥劑量來開展本文的研究。40只雄性昆明小鼠隨機分為4組，即正常組、模型組、TAL低劑量組(30 mg/kg)和TAL高劑量組(100 mg/kg)，每組10只。灌胃給藥每日1次，持續7日。末次給藥2 h后，腹腔注射APAP(300 mg/kg)制備急性肝損傷模型[15]，12 h后，開始后續實驗。

1.2.3 樣本制備與相關生理生化指標測定

麻醉小鼠，取血，分離血清，檢測血清中ALT和AST水平。脫頸椎處死小鼠，剖取肝臟，取小鼠肝右葉組織置于10%緩沖福爾馬林中保存，進行蘇木素-伊紅染色，觀察肝臟組織病理變化。另取一部分肝組織按1∶9比例加入冰生理鹽水，勻漿、離心，制備肝勻漿，檢測肝組織中MDA、GSH含量以及抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活力，ELISA法檢測肝組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。所有實驗操作均按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 肝臟細胞核抽提物的制備

按照試劑盒說明書規定的實驗步驟操作，制備小鼠肝臟組織細胞核的抽提物。

1.2.5 免疫印跡

首先，用SDS-PAGE電泳法分離蛋白質樣本(每泳道上樣25 μg蛋白)。電泳結束后，將膠中的蛋白轉印到PVDF膜上。然后，用5%脫脂奶粉封閉膜。將膜依次與相應的一抗(1∶1 000稀釋)和酶標二抗(1∶1 000稀釋)孵育。最后，用ECL化學發光底物進行發光顯影，用Image J軟件對所得圖像進行蛋白質條帶的半定量分析。

1.2.6 定量PCR

用Trizol提取肝臟組織RNA。取5 μg總RNA，用cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA反轉錄成為cDNA。以GAPDH基因為內參，用熒光定量PCR對HO-1和GCLC的轉錄水平進行量化分析。引物序列如下(5′至3′)。小鼠HO-1(正向)：AGG TAC ACA TCC AAG CCG AGA；小鼠HO-1(反向)：CAG TGA GGC CCA TAC CAG AAG。小鼠GCLC(正向)：CTA CCA CGC AGT CAA GGA CC；小鼠GCLC(反向)：CCT CCA TTC AGT AAC AAC TGG AC。小鼠GAPDH(正向)：AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG；小鼠GAPDH(反向)：CTT CCC ATT CTC GGC CTT G。

PCR反應結束后，以GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，三磷酸甘油醛脫氫酶)為內參，計算各個基因的相對表達水平[16]。

1.3 統計學分析

所有實驗數據均以平均數±標準差表示。采用軟件SPSS對實驗數據進行統計分析，當P< 0.05時，可認為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 TAL對APAP肝損傷小鼠肝臟指數及血清ALT、AST水平的影響

與正常組相比，模型組小鼠出現肝臟腫大，肝臟指數顯著上升(P< 0.01)。給予不同劑量的TAL后，肝臟指數均顯著降低(P< 0.05或P< 0.01)。模型組小鼠血清中ALT和AST水平明顯高于正常組(P< 0.01)。TAL劑量依賴性地降低了肝損傷小鼠血清中的ALT和AST水平(P< 0.01)。

表1 TAL對小鼠肝臟指數及血清中ALT、AST水平的影響(n = 10，±s)

注：與正常組比較，##P< 0.01；與模型組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note:Compared with normal group,##P< 0.01;Compared with model group,*P< 0.05，**P< 0.01.

2.2 TAL對APAP肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響

如圖1所示，與正常組相比，模型組小鼠的肝臟可見明顯組織病理學變化，包括組織細胞排列不整齊，部分肝細胞細胞核缺失，組織內出血以及炎性細胞浸潤。TAL有效地緩解了APAP誘導的這些組織病理學變化。

圖1 TAL對小鼠肝組織形態學的影響(400×)Fig.1 Effects of TAL on the morphology of mouse liver tissues (400×)

2.3 TAL對APAP肝損傷小鼠肝組織中MDA與GSH含量的影響

如下表所示，模型組小鼠肝組織中MDA含量較正常組有明顯升高(P< 0.01)。經TAL處理后，小鼠肝組織中MDA含量顯著下降(P< 0.01)。與正常組相比，模型組小鼠肝組織中GSH含量顯著降低(P< 0.01)。TAL低、高劑量組GSH含量則有顯著升高(P< 0.01)。

表2 TAL對肝組織中的MDA與GSH含量的影響(n = 10，±s)

注：與正常組比較，##P< 0.01；與模型組比較，**P< 0.01。

Note:Compared with normal group,##P< 0.01;Compared with model group,**P< 0.01.

2.4 TAL對APAP肝損傷小鼠肝組織中SOD、CAT和GSH-Px活力的影響

經APAP處理后，小鼠肝組織中抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px的活力顯著降低(P< 0.01)。與模型組相比，TAL劑量依賴性地增強了小鼠肝組織中SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶的活力(P< 0.05或P< 0.01)。

表3 TAL對肝組織中SOD、CAT和GSH-Px活性的影響(n = 10，±s)

注：與正常組比較，##P< 0.01；與模型組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note:Compared with normal group,##P< 0.01;Compared with model group,*P< 0.05，**P< 0.01.

2.5 TAL對APAP肝損傷小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響

TNF-α、IL-1β和IL-6是典型的炎癥因子。在模型組小鼠肝組織中，這三個細胞因子的含量均顯著上升(P< 0.01)。TAL劑量依賴性地下調了小鼠肝臟中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量(P< 0.01)。

表4 TAL對肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響(n = 10，±s)

注：與正常組比較，##P< 0.01；與模型組比較，**P< 0.01。

Note:Compared with normal group,##P< 0.01;Compared with model group,**P< 0.01.

2.6 TAL對小鼠肝臟中AMPK/Nrf2途徑的影響

如圖2A所示，與正常小鼠相比，模型小鼠肝臟細胞核內的Nrf2蛋白量呈現增加的趨勢。TAL則進一步劑量依賴性地上調了Nrf2蛋白在模型小鼠肝臟細胞核中的含量(P< 0.01)。AMPK是Nrf2的重要調控因子之一。如圖2B所示，APAP對小鼠肝臟中AMPKα的磷酸化水平無明顯影響。在TAL的作用下，小鼠肝臟中AMPKα的磷酸化水平明顯提高(P< 0.01)。

圖2 TAL激活模型小鼠肝臟中的AMPK/Nrf2通路Fig.2 TAL activated the AMPK/Nrf2 cascade in the liver of mice

2.7 TAL對小鼠肝臟中Nrf2下游基因表達水平的影響

實驗結果如圖3A和3B所示。HO-1和GCLC都是典型的Nrf2下游基因。與正常小鼠相比，模型小鼠肝臟中這兩個基因的表達水平有上升趨勢。與模型小鼠相比，TAL可以在mRNA和蛋白質水平明顯上調HO-1和GCLC的表達(P< 0.05或P< 0.01)。

圖3 TAL上調模型小鼠肝臟中Nrf2下游基因的表達Fig.3 TAL elevated the expression of Nrf2-responsive genes in the liver of mice

3 討論

肝細胞受損時，動物血清中的ALT和AST水平將顯著升高。與正常組相比，模型組小鼠血清中的ALT和AST活性均有大幅升高，提示APAP誘導了顯著的肝損傷。TAL有效降低了血清中這些酶的活性。這提示TAL對于APAP誘導的肝損傷具有明顯的緩解作用。與此一致的是，TAL可明顯改善APAP誘導的小鼠肝組織病變。

過量的APAP會大量消耗GSH，降低肝細胞的抗氧化能力，從而引起胞內脂質過氧化，MDA含量上升[17]。施用TAL能顯著提高肝損傷小鼠肝組織中的GSH水平，抑制MDA生成。APAP過量時，肝臟中發生氧化應激反應，導致抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px的活性降低。與模型組相比較，TAL各劑量組小鼠SOD、CAT和GSH-Px的活性均有上升。表明TAL可上調抗氧化酶的活性，提高機體的抗氧化能力。在APAP的作用下，肝臟中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平會明顯升高。炎癥因子的積聚進一步加劇了APAP誘導的肝損傷[18]。在本研究中，TAL可顯著下調模型小鼠肝組織中炎癥因子的含量，抑制炎癥反應的發生。以上研究結果綜合說明，TAL能顯著緩解APAP誘導的小鼠急性肝損傷。

AMPK是一個由三條肽鏈組成的絲/蘇氨酸蛋白激酶。AMPKα是AMPK的催化亞基。AMPKβ和AMPKγ是AMPK的調節亞基。細胞內AMP水平增加時，AMPK由低活性的形式轉變為高活性的形式，從而啟動其下游分子事件。AMPKα上172位蘇氨酸殘基的磷酸化是AMPK被激活的重要標志。AMPK可通過以下三方面機制對Nrf2通路起到正向調控作用。其一，AMPK可直接催化Nrf2蛋白中550位絲氨酸殘基的磷酸化而促進Nrf2的細胞核轉位[19]。其二，活化的蛋白激酶GSK-3β可以通過誘導Nrf2出細胞核而終止Nrf2介導的基因轉錄。AMPK可通過催化GSK-3β上第9位絲氨酸的磷酸化而抑制GSK-3β的活性，從而拮抗GSK-3β對Nrf2的抑制作用[20]。其三，p62是一個磷酸化依賴的Nrf2活化因子。磷酸化的p62蛋白可通過與Nrf2蛋白相互作用而促進Nrf2的細胞核轉位[21]。AMPK則可直接催化p62蛋白的磷酸化，從而有利于Nrf2通路的激活[22]。在APAP的作用下，肝臟內的氧化應激有代償性上調肝內Nrf2通路活性的趨勢。但是，這種對Nrf2的激活作用較弱，不呈現統計學意義，也不足以消除APAP誘導的氧化應激[23]。與模型小鼠組相比，TAL能明顯促進Nrf2蛋白向細胞核內聚集并誘導Nrf2下游基因HO-1和GCLC的表達。這些研究結果提示TAL對于小鼠肝臟中的Nrf2通路具有明顯的激活作用。另一方面，TAL能明顯誘導小鼠肝臟內AMPKα的磷酸化。這提示提高AMPK的活性在TAL激活肝臟Nrf2通路的過程中可能起到了關鍵性作用。與我們的結果類似的是，小分子化合物dioscin和esculentoside A等亦可通過作用于AMPK/Nrf2通路來誘導HO-1和GCLC的高表達，以此緩解硫代乙酰胺和APAP誘導的肝損傷[24,25]。以上研究結果進一步提示，激活AMPK/Nrf2通路可能可以作為利用小分子化合物來干預毒物所致肝損傷的一種可行策略。