吳茱萸堿聯(lián)合吉西他濱對舌鱗癌荷瘤裸鼠模型的抑制作用及其機制研究

劉延美，汪 靜，李 月，趙家元，袁雪敏，祝靜莉，王 靜*

1鎮(zhèn)江市口腔醫(yī)院，鎮(zhèn)江 212002； 2蘭州大學口腔醫(yī)學院，蘭州 730000

舌鱗癌的發(fā)病率一直位居口腔頜面部癌之首。傳統(tǒng)手術及放化療等治療舌癌帶來的致殘性和全身毒副反應等尚不能達到理想的治療效果。吳茱萸堿(Evodiamine，Evo)是從吳茱萸果實中提取的一種重要的生物堿成分，已知具有血管舒張、鎮(zhèn)痛、抗炎和抗腫瘤等藥理作用。據(jù)報道它是通過抗增殖和誘導腫瘤細胞凋亡對癌癥產生抑制作用[1-3]。盡管學者們對Evo的抗癌活性做了一些研究，但其作用機制到目前仍不完全清楚。

中西醫(yī)結合法不僅能夠增強抗癌療效、減少毒副反應、延長生存期、提高生存質量、減少手術并發(fā)癥，而且能提高機體的免疫力。Du等[4]研究結果顯示，與小檗堿或Evo單獨處理相比，小檗堿和Evo聯(lián)合處理以時間依賴性方式協(xié)同抑制MCF-7細胞的增殖并使細胞處于G0 / G1期，表現(xiàn)為CDK抑制、p21和p27的表達水平增加，同時伴隨著細胞周期關卡蛋白、細胞周期蛋白D1、細胞周期蛋白E、CDK4和CDK6的表達水平的降低。我們課題組前期體內外實驗研究也已證實Evo聯(lián)合放射線治療能夠增強胃癌SGC7901細胞的放射敏感性，抑制舌鱗癌Tca-8113 細胞及裸鼠移植瘤的生長[5-7]。為進一步了解Evo聯(lián)合治療的作用療效，本研究首次將中藥Evo聯(lián)合西藥吉西他濱(Gemcitabine，Gem)對舌鱗癌荷瘤裸鼠進行干預，觀察聯(lián)合治療對裸鼠移植瘤的抑制作用，了解其毒副反應，并對誘導細胞凋亡的分子機制進行初步探討，從而為Evo聯(lián)合化療藥物在生物醫(yī)學領域中的應用提供理論基礎，為舌鱗癌的防治提供新的思路。

1 實驗材料

1.1 腫瘤細胞

Cal-27舌鱗癌細胞由我實驗室保存，培養(yǎng)于含體積分數(shù)10% 的胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液中，在37 ℃、含5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞單層貼壁生長鋪滿瓶底70%～80% 時，0.25%胰蛋白酶消化并傳代。

1.2 實驗動物

BALB/C nu/nu裸小鼠，雄性，4～5周齡，18～22 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司(合格證書號：SCXK(京)2012-0001)，飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學SPF級中心實驗室，所用籠具、墊料、飼料、飲用水均經過高溫高壓蒸汽滅菌處理。

1.3 藥物及試劑

吳茱萸堿(中國食品藥品檢定研究院，中國；質量分數(shù)>99%)使用前溶于蒸餾水中，吉西他濱(ELI LILLY公司，法國)使用前溶于0.9%氯化鈉注射液中；高糖DMEM細胞培養(yǎng)基(GiBco公司，美國)；二甲基亞砜(Sigma公司，美國)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，中國)；Anti-P65抗體(Sigma公司，美國)；Anti-Ik-βα抗體(Abbkine公司，美國)；Anti-Bcl-2，Anti-Bcl-xl，Anti-Bax及Anti-β-actin 抗體(Immuno Way公司，美國)；兔SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，中國)。

2 實驗方法

2.1 舌鱗癌荷瘤裸鼠模型建立

胰蛋白酶消化對數(shù)生長期Cal-27細胞，1 000 rpm離心5 min后將細胞重懸于不含血清的DMEM培養(yǎng)基中。0.2 mL/只注射于裸小鼠左腋側皮下，每只裸鼠注射2×106個細胞。

2.2 實驗分組及藥物干預

移植瘤直徑長至約5 mm時,將裸鼠按體重大小隨機分為模型對照組(Control)、吳茱萸堿組(Evo)、吉西他濱組(Gem)和聯(lián)合組(Evo+Gem)，模型對照組腹腔注射0.2 mL生理鹽水，吳茱萸堿組灌胃給予Evo(10 mg/kg/0.2 mL),吉西他濱組腹腔注射Gem(50 mg/kg/0.2 mL)，聯(lián)合組為灌胃給予Evo(10 mg/kg)和Gem(50 mg/kg)各0.2 mL，每3天一次，前后共用藥10次，末次用藥3天后頸椎脫臼法處死裸鼠。

2.3 生活指標觀察

從分組當天開始，每3天測量一次裸鼠的進食量及進水量，每7天測量一次裸鼠對外界刺激反應頻率并繪制折線圖。

2.4 HE染色觀察腫瘤及各臟器組織形態(tài)

瘤體用10%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成4 μm切片,二甲苯脫蠟，經各級乙醇至水，蘇木素染色，鹽酸乙醇分化，返藍，伊紅染色，脫水，透明，封片，中性樹脂封固，鏡下觀察。

2.5 透射電鏡觀察腫瘤細胞超微結構

腫瘤組織樣品用2.5%戊二醛預固定，1/15M PBS液漂洗3次，10～15 min/次，1%四氧化鋨后固定1.5 h，1/15M PBS液漂洗3次，10～15 min/次，乙醇梯度脫水，10～15 min /次，100%純丙酮2次，20 min /次，包埋劑(1:1丙酮:EPON-812樹脂(Shell Chemicals,Houston,TX))浸透1 h，包埋，35 ℃/24 h、45 ℃/24 h、68 ℃/24 h聚合，置LKB超薄切片機上作超薄切片，厚約50～70 nm，切片置于覆有200目的銅網上，枸櫞酸鉛、醋酸柚雙染，透射電鏡下觀察。

2.6 免疫組織化學染色觀察移植瘤組織中P65、Ik-βα、Bcl-2、Bax的表達。

石蠟切片烤片，脫蠟，經各級乙醇至水，修復液修復，依次加入內源性過氧化物酶阻斷劑，封閉用正常山羊血清工作液，一抗(P65、Ik-βα、Bax、Bcl-2)室溫下孵育過夜。滴加生物素標記山羊抗兔IgG，室溫孵育15 min，滴加辣根酶標記鏈霉素卵白素工作液，室溫孵育15 min。DAB顯色，脫水，透明，封片，中性樹脂封固，鏡下觀察。

2.7 Western blot分析Ik-βα及 Bax的蛋白表達

提取移植瘤組織蛋白，加SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，95 ℃加熱5 min使蛋白質變性，微量分光光度計測定蛋白含量，調整每個樣品蛋白濃度。根據(jù)目的蛋白分子量大小配制分離膠、積層膠進行電泳、轉膜，牛奶封閉，一抗(Anti- Ik-βα：1∶1 000； Anti- Bax：1∶1 000)孵育過夜，洗膜，二抗孵育，暗盒內曝光分析。

2.8 統(tǒng)計學處理

3 實驗結果

3.1 吳茱萸堿聯(lián)合吉西他濱顯著抑制了裸鼠皮下移植瘤的生長

末次用藥后3天處死動物獲取腫瘤組織觀察，干預組瘤體體積明顯小于模型對照組，聯(lián)合組體積最小。

圖1 裸鼠移植瘤代表性圖像及瘤體積Fig.1 Representative images and tumor volumes of transplanted nude mice 注：與模型對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。Note:compared with the model control group, *P<0.05;**P<0.01.

3.2 吳茱萸堿聯(lián)合吉西他濱對舌鱗癌荷瘤裸鼠生活質量的影響

給藥期間，各組裸鼠進食量、進水量、對外界刺激反應頻率均有下降趨勢，與模型對照組相比，藥物干預組下降緩慢(P<0.05)，聯(lián)合組下降最慢(P<0.01)，提示聯(lián)合治療提高了荷瘤鼠的生活質量。

圖2 裸鼠進食、進水量及應激反應變化曲線圖 Fig.2 Curve of feeding,water intake and stress response of nude mice 注：與模型對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。Note:Compared with the model control group, *P<0.05;**P<0.01.

3.3 吳茱萸堿聯(lián)合吉西他濱對舌鱗癌荷瘤裸鼠生物毒性影響

由圖3可知，各組裸小鼠的心肌組織纖維排列致密,結構清晰，未見異常；肝小葉結構完整，肝細胞排列整齊，形態(tài)正常，未見明顯病理改變；肺組織支氣管、肺泡結構清晰，支氣管上皮完整，肺泡結構連續(xù)，肺泡壁完整，肺泡間隔無充血水腫，肺泡腔無擴大，且未見明顯滲出；脾臟組織的紅髓、白髓及邊緣界清晰，形態(tài)均未見異常；腎組織的腎小球、腎間質血管及腎小管上皮細胞正常，未見明顯病理改變。

圖3 HE染色觀察臟器組織形態(tài)(×400)Fig.3 HE staining to observe the organ morphology (×400)

圖4 移植瘤組織石蠟病理光學顯微鏡切片(×400) Fig.4 Paraffin pathological light microscopy (×400) of transplanted tumor tissue

3.4 腫瘤組織HE染色觀察

模型對照組癌細胞豐富，生長旺盛，呈彌漫性生長，腫瘤細胞大小不一，形態(tài)各異，異型性明顯，分化差，核漿比例大，染色較深，形態(tài)不規(guī)則，病理性核分裂像多見；Evo組腫瘤細胞排列較規(guī)則，數(shù)目減少、體積減小，異型性小，核固縮，核分裂像少；Gem組腫瘤細胞體積減小，異型性小，分化好，核固縮，核分裂像少；聯(lián)合組中腫瘤細胞體積減小，異型性較小，分化較好，核固縮，核分裂像少見(圖4)。

3.5 免疫組織化學檢測分析結果

光學顯微鏡下觀察，Bax蛋白陽性表達為胞質呈棕黃色顆粒，與模型組相比，Evo組、Gem組明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，聯(lián)合組Bax上調最明顯(P<0.01)。Bcl-2蛋白陽性表達為胞質呈棕黃色顆粒，Evo組、Gem組表達量明顯減少，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意(P<0.05)，聯(lián)合組Bcl-2下調最明顯(P<0.01)。P65蛋白陽性表達為胞質或(和)胞核呈棕黃色顆粒，Evo組、聯(lián)合組表達量明顯減少，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意(P<0.05)。Ik-βα蛋白陽性表達為胞漿呈棕黃色顆粒，Evo組、聯(lián)合組表達量明顯增多，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。應用Image-Pro Plus 6.0 軟件對蛋白陽性表達進行半定量分析(圖5)。

圖5 免疫組織化學分析移植瘤組織中Bax、Bcl-2、P65和Ik-βα的蛋白表達 Fig.5 Immunohistochemical analysis of protein expression of Bax,Bcl-2,P65 and Ik-βα in transplanted tumor tissues注：與模型對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。Note:compared with the model control group, *P<0.05;**P<0.01.

3.6 透射電鏡下腫瘤細胞超微結構

透射電鏡下觀察模型組腫瘤細胞核體積較大，表面可見微絨毛，胞膜完整，形態(tài)不規(guī)則，染色質均勻，胞質內可見大量線粒體、游離核糖體及內質網等細胞器；Evo組、Gem組細胞體積變小，染色質邊集，呈現(xiàn)高密度影像，微絨毛數(shù)量減少或消失，呈現(xiàn)早期凋亡特征；聯(lián)合組核內異染色質碎裂，邊集，濃縮成團塊狀，分部在核膜內側，胞膜不完整，核固縮、碎裂，呈現(xiàn)晚期凋亡特征(圖6)。

圖6 透射電鏡觀察裸鼠皮下移植瘤腫瘤細胞形態(tài)(×6000)Fig.6 Transmission electron microscope observation of tumor cell morphology in nude mice subcutaneous xenografts (×6 000)

3.7 Western blot檢測移植瘤組織中 Bax、Ik-βα蛋白表達

如圖7所示，與模型對照組相比，Evo組和Gem組均能上調Bax(P<0.05)的表達，與單藥組相比，聯(lián)合組上調更為明顯(P<0.01)，與模型組相比，Evo組和聯(lián)合組明顯上調了Ik-βα(P<0.05)的表達。

圖7 吳茱萸堿聯(lián)合吉西他濱對移植瘤組織中Bax、Ik-βα蛋白表達的影響Fig.7 Effect of Evodiamine combined with Gemcitabine on expression of Bax and Ik-βα protein in transplanted tumor tissues注：與模型對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。Note:compared with the model control group, *P<0.05;**P<0.01.

4 結論

近年來從天然植物中尋找抗癌成分成為學者們研究的熱點。Hu等[8]研究結果顯示Evo能使BGC-823細胞對放射治療敏感并顯著抑制異種移植瘤的生長。Zhang等[9]研究發(fā)現(xiàn)Evo可能通過mTOR/S6K1介導的Mcl-1下調誘導細胞凋亡并增強腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)誘導的細胞凋亡。我們課題組前期的細胞學實驗研究結果顯示Evo聯(lián)合Gem能顯著抑制Cal-27舌鱗癌細胞的增殖。基于此，本研究首次將Evo與Gem聯(lián)合對Cal-27舌鱗癌裸鼠進行藥物干預，結果發(fā)現(xiàn)兩種藥物對皮下移植瘤的生長均具有抑制作用(P<0.05)，聯(lián)合應用時作用更為顯著(P<0.01)。實驗期間，聯(lián)合組裸鼠進食量、進水量較模型組(P<0.01)及單藥組(P<0.05)下降緩慢。實驗期間，裸鼠對外界刺激反應頻率逐漸減弱，聯(lián)合組減弱速度最為緩慢(P<0.01)。HE染色觀察聯(lián)合組相比較單藥組病理性核分裂像少見，證實兩藥聯(lián)合具有協(xié)同抑制作用。實驗結束時，4個組中無動物死亡，HE染色結果顯示四組中五臟器形態(tài)結構正常，未見病理改變。以上結果提示吳茱萸堿及吉西他濱均具有抗舌鱗狀細胞癌的作用，聯(lián)合應用時抑制作用更明顯，且無明顯毒副作用，用藥方法及劑量均在安全范圍內。

Bcl-2、Bax 是Bcl-2家族中較為經典的抗凋亡及促凋亡蛋白，兩者表達的增高和降低很大程度上反應了腫瘤細胞的凋亡水平。P65是NF-κB信號通路中最為典型的成員之一，而Ik-βα則是Ik-β中最典型的成員，也是NF-κB活化過程中最強的負反饋因子，它能與P65結合防止其入核，從而導致NF-κB活化過程的迅速開啟和關閉。為了進一步探討Evo、Gem聯(lián)合作用的機制，我們檢測了移植瘤組織中Bcl-2、Bax、P65，Ik-βα的表達。結果發(fā)現(xiàn)Evo組及聯(lián)合組的P65蛋白表達下調，Ik-βα表達上調。藥物干預組相比較模型對照組Bcl-2下調，Bax上調，聯(lián)合組最為顯著(P<0.01)。提示吳茱萸堿聯(lián)合吉西他濱抑制舌鱗狀細胞癌的生長可能與下調NF-κB/p65、Bcl-2，以及上調Ik-βα、Bax等蛋白表達相關。

中藥聯(lián)合化療因具有增強療效、減少毒副反應等優(yōu)勢備受大家的關注和重視。雖然吳茱萸堿的抗腫瘤作用已被多位學者證實，但其抗腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制較為復雜，通常涉及多個信號通路。Hu等[10]研究發(fā)現(xiàn)WWOX在HepG2和Hepa1-6細胞中的敲除減弱了Evo對癌細胞的生長抑制效應，表明Evo通過WWOX依賴性途徑誘導了抗癌活性。Evo可以通過誘導Akt介導的細胞凋亡發(fā)揮抗肝細胞癌(HCC)作用[11]，或是通過抑制β-連環(huán)蛋白而對HCC產生抗腫瘤作用[12]。Lin等[13]研究結果發(fā)現(xiàn)，Evo顯著降低A549細胞中AKT /核因子-κB(NF-κB)和Sonic hedgehog / GLI家族鋅指1(SHH / GLI1)信號通路的活性。Sui等[14]研究首次提出Evo可以通過阻斷人類結腸直腸癌中的p-NF-κB信號通路來減弱多藥耐藥性。Zhao等[15]研究結果表明，Evo通過下調PGI以抑制HCT-116人類結腸直腸癌細胞的遷移，通過失活JAK2 / STAT3途徑來調節(jié)p53信號傳導途徑的活性以誘導細胞凋亡并下調MMP3表達。Liu等[16]等研究結果表明Evo在神經膠質瘤細胞中誘導細胞內鈣/ JNK信號介導的自噬和鈣/線粒體介導的細胞凋亡。Yang等[17]研究結果示：Evo通過誘導SHP-1阻斷STAT3信號通路并在體外和體內對肝癌細胞發(fā)揮抗腫瘤效應。

吳茱萸堿尚未作為抗腫瘤藥物在臨床上應用，對其進一步的研究尤其是聯(lián)合治療的開發(fā)，抗腫瘤分子機制的研究仍然任重而道遠。相信隨著對吳茱萸堿研究的進一步深入，其抗腫瘤作用及聯(lián)合作用的機制將逐漸被闡明，從而有一個更加清楚和全面的了解，為其應用開拓一片更廣闊的天地。