枸杞多糖的抗炎鎮痛作用研究

杜軍霞，宮彬彬，宋 菲，蓋璐楠

邢臺學院生物科學與工程學院，邢臺 054001

枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharides，LBP)是枸杞中主要生物活性成分之一，具有抗輻射、抗腫瘤、降血糖等多種藥理作用[1,2]。研究顯示LBP能夠提高機體特異性免疫及機體自然殺傷細胞的殺傷力，提升白細胞水平，對脾臟和胸腺T細胞有刺激作用，還能增強機體的細胞免疫和體液免疫功能，同時也表現出顯著的抗炎作用[3,4]，體外研究證明LBP能夠降低致炎因子一氧化氮(NO)、前列腺素E2(PGE2)、腫瘤壞死因子(TNF-)、白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)等分子的含量，并且顯著抑制了炎癥相關蛋白ERK、p38、MAPK等的基因表達，表現出良好的抗炎作用[3]。炎癥往往伴隨著慢性疼痛出現，即炎癥痛，其發生發展過程與外周致炎因子的含量有關，更重要的是發生在神經系統內部的敏化機制。有研究顯示LBP能夠明顯緩解了坐骨神經損傷模型大鼠的自噬和疼痛現象，同時抑制了神經瘤的形成[5]，但關于LBP在體的抗炎和鎮痛作用的報道少見。本文通過小鼠福爾馬林炎癥疼痛模型，觀察LBP的抗炎鎮痛作用并對其抗炎癥痛作用的分子機制進行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級昆明小鼠20～22 g，雄性30只，雌性20只，購于河北醫科大學實驗動物中心(許可證號：SCXK(冀)2018-004)；出生后7～8天大鼠，購于北京大學醫學部實驗動物中心(許可證號：SCXK(京)2016-0010)。

1.2 主要實驗材料和試劑

枸杞多糖(LBP)(北京源葉生物公司)，小鼠IL-6ELISA試劑盒(江蘇酶免實業有限公司，1706H)，38%甲醛溶液，Neurobasal 試劑(Invitrogen),Fura-2 AM(Biotium)，辣椒素(Enzo Life Sciences)，2.5 M KCl(Sigma)，PBS(NaCl 8 g，Na2HPO4·POg2O 2.08 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.2 g溶于800 mL ddH2O中，調pH值至7.2～7.4，定容至1 L)，ES液(NaCl 7.6 g，KCl 0.37 g，KH2PO40.272 g，CaCl20.277 5，MgCl20.095 g，HEPES 2.383 1 g，glucose 1.8 g，溶于900 mL dd H2O 中，溶解完全后調pH值至7.2，定容至1 L，用蔗糖調節滲透壓至295～300 mOsm)。

1.3 動物行為學實驗

1.3.1 小鼠熱板實驗

雌性昆明小鼠20只，隨機分為對照組(Ctr)和實驗組(LBP)，灌胃給藥前分別將小鼠放入52 ℃恒溫水浴板上，以小鼠舔足為指標，觀察記錄小鼠熱板潛伏期作為基值，之后兩組分別灌胃給予生理鹽水(2 mL/kg體重)或LBP(20 mg/kg體重)溶液，連續7天，1次/天，于最后一次灌胃30 min后進行熱板實驗，記錄小鼠熱板潛伏期，并與基值作比值來反映LBP對熱板反應潛伏期的影響。

1.3.2 小鼠福爾馬林炎癥模型實驗

雄性昆明小鼠30只隨機分為對照組(Ctr)、模型組(FM)、實驗組(LBP)三組。模型組和實驗組分別灌胃生理鹽水(2 mL/kg體重)和LBP(20 mg/kg體重)連續7天，1次/天，于最后一次灌胃后在右后足底皮下注射1%福爾馬林20 μL，觀察并記錄小鼠的I相和II相自發痛行為。

1.4 IL-6的檢測

福爾馬林痛模型4 h后迅速摘眼球取血，將血液室溫靜置40 min，取上層血清備用。取血后小鼠經斷頭處死，迅速用手術剪縱向剪開背部皮膚，取下頸椎至尾椎部位的脊柱，用灌有4 ℃預冷生理鹽水的20 mL注射器將脊髓從椎管中推出，取其腰膨大處約1.5 cm長度的組織，用預冷PBS溶液進行冰上研磨20 min，4 ℃ 10 000 rpm離心5 min，并取上清備用。采用小鼠IL-6分子ELISA試劑盒對血清和脊髓裂解液中的IL-6進行檢測。

1.5 鈣成像實驗

原代培養出生后7～8天的大鼠DRG組織細胞，正常培養2～3天后換用LBP(80 μg/mL)(LBP組)或生理鹽水(Ctr組)進行預處理6 h，用ES液輕洗細胞兩次，加入適量稀釋于ES液的終濃度5 M Fura2-AM，室溫孵育40 min，換為ES液，室溫恢復1 h后，于鈣成像試驗平臺進行實驗記錄基礎鈣離子信號狀況，信號穩定后加入1 μM辣椒素刺激，同時觀察鈣離子信號變化。以F340/F380比值變化代表細胞內鈣離子濃度變化。利用2.5 M KCl對神經元進行刺激，以排除整體活性低和狀態較差的細胞。

1.6 數據統計

數據處理采用t-檢驗(t-tests)和多因素方差分析(Two-way ANOVA)，數據分析及作圖用Graph Pad Prism 5軟件進行。

2 結果

2.1 LBP對生理性熱痛覺影響

為檢測LBP對生理性痛覺的影響，進行熱板實驗，結果顯示，LBP處理前后，小鼠的熱板反應潛伏期變化不明顯，熱板反應潛伏期與基值的百分比與對照組(Ctr)小鼠相比并無顯著性差異(圖1)，說明LBP對于小鼠的正常生理性熱痛覺感受功能沒有明顯影響。

圖1 LBP對小鼠熱板實驗潛伏期的影響Fig.1 The effect of LBP on latent period of hot plate test注：NS代表LBP組和對照組比較，無顯著性差異。Note:NS showed no significant difference between LBP group and saline control group.

2.2 LBP對福爾馬林炎癥痛模型具有鎮痛作用

給小鼠右后足底注射1%福爾馬林20 μL，模型組(FM)小鼠出現明顯的兩相疼痛，與空白對照組小鼠相比出現典型的自發痛行為表現。LBP組的小鼠I相痛和模型組相比沒有出現差異，但在II相痛15～25 min期間，每5 min舔足和抬足時間顯著降低，與模型組相比，具有顯著性差異(P<0.05)(圖2)，證明枸杞多糖對于福爾馬林炎癥痛引起的II相痛的確具有良好的緩解作用。對照組(Ctr)小鼠未進行任何處理，用于證明福爾馬林模型的穩定性。

圖2 LBP對福爾馬林炎癥痛模型小鼠的鎮痛作用Fig.2 Analgesic effect of LBP on formalin induced inflammatory pain in mice 注：***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05 LBP組與模型組比較。Note:***P<0.001,**P<0.01 and *P<0.05 LBP group was compared with model control group.

2.3 LBP緩解福爾馬林誘發的炎癥表現

注射福爾馬林4 h后將小鼠脫臼處死，稱取其兩側后足重量并進行比較，結果顯示，三組小鼠左后足質量均無差異，而模型組小鼠的兩后足重量差與正常對照組相比增加，具有顯著性差異(P<0.001)，LBP組小鼠的兩后足重量差與模型組相比有所減少，具有顯著性差異(P<0.001)(圖3)。

圖3 LBP對福爾馬林注射足重量的影響Fig.3 Effect of LBP on foot weight of formalin injected mice 注：NS代表三組相比無顯著性差異；***P<0.001模型組和空白對照組相比；###P<0.001LBP組與模型組比較。Note:NS showed no significant difference between the three groups;***P<0.001 model control group and blank control group were compared;###P<0.001 LBP group and model control group were compared.

2.4 LBP降低福爾馬林引起的炎癥因子釋放

注射福爾馬林4 h后，取外周血液及脊髓組織并檢測其中的IL-6含量。結果顯示模型組小鼠的血清中和脊髓組織中的IL-6的含量均顯著增加，與空白對照組相比具有統計學差異(P<0.001)，而LBP組小鼠的血清及脊髓組織IL-6含量升高程度明顯受到抑制，與模型組相比，具有統計學差異(P<0.001、P<0.05)(圖4)，提示LBP能夠同時降低外周和神經中樞內的炎癥因子釋放。

圖4 LBP對小鼠組織中IL-6含量的影響Fig.4 Effect of LBP on the content of IL-6 in mouse tissues注：***P<0.001，**P<0.01模型組與空白對照組相比；###P<0.001，#P<0.05LBP組與模型組相比。Note:***P<0.001,**P<0.01 model control group was compared with blank control group;###P<0.001 and #P<0.05 LBP group was compared with model control group.

2.5 LBP降低TRPV1的功能活性

LBP 80 μg/mL預處理原代培養的DRG神經元6 h，進行鈣成像實驗，結果顯示，LBP顯著降低了1 μM辣椒素刺激所引起的鈣信號增加現象，加入辣椒素后0～1 min內鈣信號具有統計學差異，說明LBP減弱了離子通道TRPV1的功能活性(圖5)。

圖5 LBP降低DRG神經元上TRPV1功能活性Fig.5 LBP reduces TRPV1 functional activity on DRG neurons 注：*P<0.05LBP組與生理鹽水對照組比較。Note:*P<0.05 LBP group was compared with saline control group.

3 討論

疼痛不僅是一個世界范疇的醫學問題，也是目前在人群中普遍存在的健康問題之一。疼痛的研究機制不明，現有藥物有各自的副作用或欠佳的療效，迄今為止臨床上并無有效特異的治療方法。多種生物的活性物質都有減輕炎癥甚至緩解炎癥痛的效果，但相關分子機制研究卻少之又少，很大程度限制了天然消炎鎮痛藥物的臨床應用。本實驗結果一方面通過在體實驗中大鼠足部腫脹程度和血清中IL-6含量兩種指標進一步驗證了LBP的外周抗炎作用。另一方面值得注意的是，LBP顯著降低了福爾馬林誘導的II相痛，但對于I相痛沒有明顯影響，用在體實驗證明了LBP在此模型中的直接鎮痛作用。由于II相痛與痛覺傳導途徑中的外周敏化和中樞敏化機制關系密切，即痛覺傳入神經元的外周端和脊髓水平的神經元可塑性有關，多種痛覺相關信號分子都參與其中，據此，LBP對II相痛的抑制很可能通過影響神經系統痛覺敏化信號通路來實現。

組織損傷后多種炎癥因子、致炎物質等參與到痛覺敏化過程中，其中IL-6是一類前炎癥因子，被報道通過增強感覺神經元反應而與痛覺可塑性有密切聯系[6]，并且參與到痛覺敏化和中樞敏化的過程中[7]。瞬時電壓感受器陽離子通道，子類V，成員1(Transient receptor potential cation channel，subfamily V， member 1，TRPV1)是痛覺敏化過程中重要的離子通道，在骨癌痛模型中，外周或中樞的IL-6均能夠通過 JAK/PI3K 信號途徑增強外周神經元DRG細胞膜上TRPV1的功能活性[8]。因此，本實驗中LBP的抗炎癥痛機制可能與降低IL-6，進一步降低了IL-6引起的TRPV1功能上調有關。我們的鈣成像實驗結果表明，在原代培養的混有膠質細胞的DRG細胞中，LBP預處理的確降低了TRPV1介導的鈣離子信號(圖5)，與上述結論相符。目前，枸杞多糖的抗炎作用已被公認，但多數停留在體外實驗，并且關于LBP是否具有直接的鎮痛作用尚無明確實驗證實，本論文通過福爾馬林炎癥實驗模型證明LBP的確具有一定的抗炎和鎮痛作用，并初步發現該鎮痛作用機制除了與外周抗炎途徑有關之外，也可能通過直接影響疼痛的神經傳導通路來實現。由于炎癥痛分子機制十分復雜，有關LBP進一步的抗炎癥痛效應和機制仍需要更進一步的研究。

致謝:感謝北京大學醫學部王韻教授課題組及北京大學醫學部神經科學研究所為本研究提供原代神經元培養實驗及鈣成像實驗平臺。