不同產地川佛手中8種化學成分的分析與評價

崔廣林，李隆云*，譚 均，張 應

1重慶市中藥研究院；2 重慶市中藥良種選育與評價工程技術研究中心；3中國中醫科學院中藥資源中心重慶分中心，重慶 400065

佛手是蕓香科柑橘屬植物佛手(CitrusmedicaL.var.sarcodactylisSwingler)的干燥果實，按其產地主要分為川佛手、廣佛手和浙佛手，具有舒肝理氣、和胃止痛、燥濕化痰的功效，用于治療肝胃氣滯，胸脅脹痛，胃脘痞滿，食少嘔吐，咳嗽痰多等病癥[1]。川佛手主要分布在四川盆地邊緣地區，主產于四川合江 、宜賓、沐川 、犍為、樂山及重慶等地[2]。佛手含香豆素、黃酮和酚酸等活性成分[3]，其中香豆素類化合物包括6,7-二甲氧基香豆素、莨菪亭、5,7-二甲氧基香豆素、7-羥基香豆素等，具有抗菌、抗腫瘤、平滑肌松弛、抗凝血和光敏等作用[4]。黃酮類成分中，橙皮苷具有抗氧化、抗炎等藥理活性[5]，《中國藥典》(2015版)將其作為藥材質量控制的主要指標成分；槲皮素具有抗癌、抗氧化、抗纖維化和抗炎等作用[6]；木犀草素是一種天然黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化、消和保護神經系統等作用[7]。酚酸類成分中，阿魏酸具有很強的抗氧化和抗炎活性[8]。目前，人們對佛手化學成分進行了一些研究[9-18]，但多集中在廣佛手和金佛手，且涉及指標較少。佛手藥材現行質量標準較為簡單，僅以單一成分橙皮苷為佛手藥材的質量評價，難以全面反映藥材真實品質。且川佛手的產地廣泛，在不同生長環境和地理位置，可能導致其質量良莠不齊，成分有差異。為了更好的綜合比較、評價不同產地川佛手的質量，本實驗首次以木犀草素、6,7-二甲氧基香豆素、莨菪亭、5,7-二甲氧基香豆素、7-羥基香豆素、橙皮苷、槲皮素、阿魏酸8種成分為指標，進行主成分分析和聚類分析，探討不同產地川佛手藥材的質量差異，旨在為制定川佛手藥材的質量標準提供參考依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津LC-20 AT 型HPLC(包括DGU-20 A5檢測器、LC-20 AT泵、SIL-20 A自動進樣器、SPD-M20 A二極管氘燈、CTO-20 A柱溫箱)(日本島津公司)，BS223 S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)，GZX-GF型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海龍躍儀器設備有限公司)；KQ(250DB型數控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

對照品木犀草素(成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST(14120224，純度≥99%)、6,7-二甲氧基香豆素(上海源葉生物有限公司，批號15011524，純度≥98%)、莨菪亭(成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-14081804，純度≥98%)、5,7-二甲氧基香豆素(成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-14070501，純度≥99%)、7-羥基香豆素(成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-14120715，純度≥98%)、橙皮苷(上海源葉生物有限公司，批號14092432，純度≥97%)、槲皮素(成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST(14082610，純度≥98%)、阿魏酸(成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-14012214，純度≥99%)冰醋酸和甲醇為色譜純(TEDIA公司)，其余試劑為分析純，水為純凈水。

1.3 樣品

試驗所用藥材樣品2015年采自川佛手主產區重慶和四川，共48份，采集地信息見表1。每個采樣點隨機選擇 10 株無明顯病蟲害的佛手植株，采集成熟果實后混勻，洗凈表面的雜質，晾干，再切成薄片，置于電熱恒溫鼓風干燥箱中，50 ℃烘干打粉，過 60 目篩備用。全部樣品均由重慶市中藥研究院李隆云研究員鑒定，為蕓香科柑橘屬植物佛手CitrusmedicaL.var.sarcodactylisSwingler 的果實。

表1 川佛手樣品來源

續表1(Continued Tab.1)

樣品號Sample No.產地Areas樣品號Sample No.產地Areas12重慶市江津區石塻鎮36四川省石棉縣天灣鄉幸福村13四川省合江縣白鹿鎮37四川省瀘定縣得妥鄉14四川省合江縣石龍鎮38四川省漢源縣洪福鄉15四川省安岳縣龍臺鎮龍西村39四川省滎經縣新添鄉16四川省安岳縣天馬鄉40四川省德陽市中江縣太平鄉17四川省合川縣草街鎮41四川省綿陽安縣花該鎮18四川省宜賓市宜賓縣蕨溪鎮42四川省南充南部縣永紅鄉19四川省宜賓市宜賓縣蕨溪鎮大坪村43四川省南充市順慶區燈臺鄉20四川省宜賓市宜賓縣蕨溪鎮正華村44重慶市云陽縣養鹿新合村21四川省宜賓市宜賓縣蕨溪鎮石坪村45重慶市云陽縣龍角鎮22四川省宜賓市宜賓縣蕨溪鎮后壩村46重慶市云陽縣養鹿同發村23四川省宜賓市屏山縣屏山鎮金象村47重慶市云陽縣養鹿桐林村24四川省宜賓市屏山縣富榮鎮撕栗村48重慶市云陽縣養鹿中山村

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo BDS HYPERSIL C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)，流動相為0.2%冰醋酸水溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～5 min，90% A；5～10 min，90%～75% A；10～18 min，75% A；18～30 min，75%～70% A；30～40 min，70%～60% A；40～60 min，60%～30% A； 90% A，保持5 min)，流速1 mL/min，進樣量10 μL，柱溫30 ℃，檢測波長322 nm。色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(A)與樣品(B)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standards ( A) and sample ( B)注：1.7-羥基香豆素 2.莨菪亭 3.阿魏酸 4.6,7-二甲氧基香豆素 5.橙皮苷 6.槲皮素 7.5,7-二甲氧基香豆素 8.木犀草素。Note:1.7-hydroxy coumarin 2.Scopoletin 3.Ferulic acid 4.6,7-dimethoxy coumarin 5.Hesperidin 6.Quercetin 7.5,7-dimethoxy coumarin 8.Luteolin.

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取木犀草素、6,7-二甲氧基香豆素、莨菪亭、5,7-二甲氧基香豆素、7-羥基香豆素、橙皮苷、槲皮素、阿魏酸對照品各3 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，靜置，得質量濃度為0.3 mg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取佛手粉末(過100目篩)約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，密塞，稱定質量；靜置1 h，超聲提取40 min，冷卻，稱定質量，用甲醇補足減失的質量，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取濾液，即得。

2.4 線性關系的考察

精密吸取2.2項下木犀草素、6,7-二甲氧基香豆素、莨菪亭、5,7-二甲氧基香豆素、7-羥基香豆素、橙皮苷、槲皮素、阿魏酸對照品溶液各1 mL，置于10加容量瓶中，定容至刻度，混勻，靜置，制樣。分別以4、8、12、16、20 μL按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積為Y縱坐標，對照品含量X為橫坐標進行線性回歸，各被測成分回歸方程和線性范圍見表2。結果表明，8種成分在一定質量濃度范圍內線性關系良好。

2.5 精密度試驗

精密吸取同一對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果木犀草素、6,7-二甲氧基香豆素、莨菪亭、5,7-二甲氧基香豆素、7-羥基香豆素、橙皮苷、槲皮素、阿魏酸峰面積的RSD分別為4.526%、2.946%、1.971%、2.455%、0.805%、3.728%、1.10%、1.321%，表明精密度較好。

表2 川佛手中8種成分的線性關系考察

2.6 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，分別于 2、4、6、8、12 h按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果木犀草素、6,7-二甲氧基香豆素、莨菪亭、5,7-二甲氧基香豆素、7-羥基香豆素、橙皮苷、槲皮素、阿魏酸的峰面積的RSD分別為4.514%、1.161%、2.148%、4.148%、0.941%、4.921%、1.303%、2.098%，說明供試品在12 h內穩定。

2.7 重復性試驗

稱取佛手粉末約0.5 g，共6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結果木犀草素、6,7-二甲氧基香豆素、莨菪亭、5,7-二甲氧基香豆素、7-羥基香豆素、橙皮苷、槲皮素、阿魏酸含量的RSD分別為4.088%、3.048%、1.915%、4.427%、1.525%、4.936%、3.074%、3.103%，說明方法重復性好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取35號佛手樣品6份，每份約0.5 g，精密稱取7-羥基香豆素、莨菪亭、阿魏酸、6,7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、槲皮素、5,7-二甲氧基香豆素、木犀草素分別為4、2、1.6、1.0、13.2、3.5、27.5、8.5 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，加入混合標準品溶液1mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，計算各成分的平均加樣回收率，結果見表3，表明本方法的回收率良好。

表3 加樣回收率試驗結果

續表3(Continued Tab.3)

成分Component樣品中含量Original amount ( mg)加入量Added amount (mg)測得量Detected amount回收率Recovery平均回收率Average recoveryRSD莨菪亭Scopoletin0.20.20 0.38 92.4791.222.120.210.20 0.39 90.870.20.20 0.38 87.850.190.20 0.37 90.560.20.20 0.38 92.410.20.20 0.39 93.15阿魏酸Ferulic acid0.160.16 0.30 90.2193.294.910.170.16 0.32 94.130.160.16 0.32 101.250.160.16 0.31 90.870.170.16 0.32 94.790.160.16 0.30 88.496,7-二甲氧基香豆素6,7-Dimethoxy coumarin0.10.10 0.20 96.5196.523.310.110.10 0.21 98.140.10.10 0.19 93.480.10.10 0.19 92.760.10.10 0.20 101.510.10.10 0.20 96.72橙皮苷Hesperidin1.321.32 2.59 96.5493.532.661.331.32 2.55 92.781.321.32 2.59 96.421.311.32 2.51 90.761.321.32 2.55 93.461.321.32 2.52 91.22槲皮素Quercetin0.350.35 0.69 96.6693.122.310.360.35 0.69 95.20.350.35 0.69 97.410.350.35 0.65 86.740.350.35 0.66 89.540.350.35 0.68 93.155,7-二甲氧基香豆素5,7- Dimethoxy coumarin2.752.75 5.40 96.5196.364.522.752.755.38 95.742.752.755.45 98.142.752.755.32 93.482.752.755.30 92.762.752.755.54 101.51木犀草素 Luteolin0.850.85 1.65 94.5293.082.280.860.85 1.65 93.130.850.85 1.62 90.750.850.85 1.67 96.420.850.85 1.63 91.210.850.851.64 92.45

2.9 樣品含量測定

按“2.3”項下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，測定不同產地川佛手樣品中7-羥基香豆素、莨菪亭、阿魏酸、6,7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、槲皮素、5,7-二甲氧基香豆素、木犀草素的含量。試驗結果表明，48批來自不同產地的川佛手藥材中8 種有效成分的含量存在差異，其中5,7-二甲氧基香豆素和橙皮苷在樣品中含量較高，6,7-二甲氧基香豆素在樣品中含量較低。具體如表4所示。

表4 48個產地川佛手中8種成分含量測定結果(mg/g, n=3)

續表4(Continued Tab.5)

樣品號Sample No.7-羥基香豆素7-hydroxy coumarin莨菪亭Scopoletin阿魏酸Ferulic acid6,7-二甲氧基香豆素6,7-Dimethoxy coumarin橙皮苷Hesperidin槲皮素Quercetin5,7-二甲氧基香豆素5,7-Dimethoxy coumarin木犀草素Luteolin350.680.350.560.399.250.705.790.36360.760.130.230.152.900.424.550.56370.400.110.100.141.530.172.040.86380.460.290.570.091.990.504.250.37390.680.060.330.193.140.6411.030.64400.270.080.420.091.640.170.610.49410.440.130.850.132.500.493.960.44421.350.180.240.407.570.5313.280.55430.450.150.270.264.280.367.580.47440.240.120.250.041.120.220.700.58450.870.230.200.256.070.276.000.51460.830.240.190.286.440.295.590.64470.440.140.110.112.020.185.910.98480.550.150.110.131.940.296.730.60

2.10 川佛手中8種化學成分之間相關性分析

以川佛手樣品中 8 化學成分的含量為數據，組建數據矩陣，采用 DPS v16.05數據處理系統對數據進行相關性分析，結果見表5。結果表明：7-羥基香豆素與6,7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、槲皮素、5,7-二甲氧基香豆素；阿魏酸與6,7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、槲皮素、5,7-二甲氧基香豆素；6,7-二甲氧基香豆素與橙皮苷、槲皮素、5,7-二甲氧基香豆素；橙皮苷與槲皮素；槲皮素與5,7-二甲氧基香豆素呈極顯著正相關，橙皮苷與木犀草素呈極顯著負相關，7-羥基香豆素與阿魏酸呈顯著正相關，木犀草素與7-羥基香豆素、阿魏酸、6,7-二甲氧基香豆素、槲皮素呈顯著負相關，化學成分間相關性較強，表明此類化學成分可能在川佛手生長過程中存在內在的相關關系。

表5 相關性分析結果

注：*P<0.05，變量相關關系顯著；**P<0.01，變量相關關系極顯著(均為雙側檢驗)。

Note:*P<0.05,significant correlation;**P<0.01,extremely significant correlation．

2.11 同產地川佛手品質的主成分分析

2.11.1 主成分分析

以48份川佛手藥材的8種化學成分檢測結果為基礎，通過DPS v16.05數據處理系統，采用主成分分析法得到各個主成分的特征值、方差貢獻率、 累計方差貢獻率及對應的特征向量(表6)。其中特征值表示了對應主成分能夠描述原有信息的多少，由表6可知主成1和主成分2特征值均大于1，其中第1主成分的方差貢獻率為49.53%，第2主成分的方差貢獻率為15.59%，累計方差貢獻率達65.12 %，具有較強的信息代表性，因此，提取前2個主成分代替原8個成分指標評價川佛手藥材的品質，以達到降維的目的。決定第一主成分大小的主要是6,7-二甲氧基香豆素、7-羥基香豆素、槲皮素和橙皮苷4個性狀分量，其中6,7-二甲氧基香豆素特征向量達0.447，是佛手藥材質量分級的最主要指標。決定第二主成分大小的主要是木犀草素和5,7-二甲氧基香豆素。由此可以看出，6,7-二甲氧基香豆素、7-羥基香豆素、槲皮素、橙皮苷、木犀草素和5,7-二甲氧基香豆素6種成分是川佛手的特征成分。

表6 8個主成分的特征向量、特征值、貢獻率及累積貢獻率

2.11.2 不同產地川佛手品質的綜合評價

以特征向量為權重構建2個主成分的表達函數式：

F1=0.443X1+0.180X2+0.341X3+0.447X4+0.390X5+0.416X6+0.278X7-0.230X8

F2=0.053X1-0.082X2+0.059X3+0.001X4-0.232X5+0.089X6+0.663X7+0.697X8

2個表達式中，X1為7-羥基香豆素、X2為莨菪亭、X3為阿魏酸、X4為6,7-二甲氧基香豆素、X5為橙皮苷、X6為槲皮素、X7為5,7-二甲氧基香豆素、X8為木犀草素。

以各個主成分對應的方差貢獻率作為權重，由主成分得分和對應的權重線性加權求和得到綜合評價函數。

F= 0.495Z1+0.156Z2

根據主成分綜合得分模型，可計算出48個產地川佛手的綜合得分值和排序結果(表7)。綜合排序的名次越前，表明就該 8 項指標而言，該樣品的質量較好，反之，質量就較差。四川省宜賓市長寧縣老翁鎮(26號)佛手樣品綜合得分最高，藥材質量最優，其次為四川省樂山市犍為縣新民鎮(32號)佛手樣品，重慶市云陽縣養鹿新合村(44號)佛手樣品綜合得分最低，藥材質量最差。

表7 主成分得分、綜合得分及排序

續表7(Continued Tab.7)

樣品號Sample No.F1F2綜合得分FComprehensive F排序Sorting390.03640.42680.0851640-2.0861-1.3845-1.2494641-0.2245-1.0456-0.27426422.5872-0.09621.266743-0.1942-0.8756-0.2332444-2.4986-1.1005-1.40848450.5011-1.17860.06418460.4887-0.87080.1061547-2.17750.6647-0.9744448-1.3431-0.3714-0.72336

2.12 不同產地佛手化學成分的聚類分析

聚類分析是將樣品按照品質特性相似程度逐漸聚合在一起， 相似度最大的優先聚合在一起，最終按照類別的綜合性質多個品種聚合，從而完成聚類分析的過程[19]。而系統聚類則是把相似的樣品或變量歸類的有效方法。因此，本實驗使用 SPSS Statistics 20對不同產地川佛手中7-羥基香豆素、莨菪亭、阿魏酸、6,7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、槲皮素、5,7-二甲氧基香豆素、木犀草素的含量測定結果進行系統聚類，以8種有效成分含量為聚類的變量，采用平方歐氏距離(squared Euclidean distance)獲得聚類分析樹狀圖，結果見圖2。由圖2可知，當閾值為10時，48個不同產地川佛手樣品被聚為3類，其中1、47、3、48、6、33、34、38、41、36、17、40、44、13、37、16、43、27、20、30、45、46、5、19、8、15、9、11、14、18、23、31、39、28聚為一類，該類樣品主要產自四川大部分地區及重慶市云陽縣，樣品特征為各化學成分含量較平均；29(四川省樂山市沐川縣新凡鄉)、35(四川省石棉縣田灣鄉)聚為一類，該類特征為橙皮苷含量較高；25、26、7、24、32、22、42、21、4、10、2、12聚為一類，該類樣品主要產自四川省宜賓市及重慶少部分地區，樣品特征為5,7-二甲氧基香豆素和木犀草素含量較高。

3 討論

佛手為2015年版中國藥典收載品種，其含量測定項下以橙皮苷含量為考察指標。本研究采集了48個川佛手產區的藥材樣品，采用HPLC技術同時測定了7-羥基香豆素、莨菪亭、5,7-二甲氧基香豆素、6,7-二甲氧基香豆素、槲皮素、橙皮苷、阿魏酸和木犀草素共8個化學成分指標，該方法操作簡便，精密度、穩定性、重復性好，可用于川佛手藥材中8種成分含量的同時測定，可以為全面評價川佛手藥材的質量提供一種切實可行的參考根據。在實驗中，通過全波長掃描(190～400 nm)確定了8種待測成分在322 nm處均有最大吸收。在最大波長下測定，提高了檢測的靈敏度，另外，在同一波長條件下完成川佛手中8種成分的含量測定，方法快捷。

圖2 48批川佛手樣品的聚類樹狀圖Fig.2 Results of dendrogram from 48 batches Fructus Citris Sarcodactylis

相關性分析旨在研究2個變量之間的變化趨勢，本研究對川佛手藥材中的 8 個成分進行了相關性分析，由相關性分析結果可知，7-羥基香豆素、6,7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、槲皮素、5,7-二甲氧基香豆素和阿魏酸之間顯著正相關，表明此類化學成分可能在川佛手生長過程中存在內在的相關關系。

主成分分析是一種多指標的綜合評價方法， 旨在利用降維的思想把多指標轉化為少數幾個綜合指標，現已廣泛用于中藥研究領域[20]。本研究以48份川佛手藥材的8種化學成分檢測結果為基礎，采用主成分分析法得到2個主成分因子。決定第一主成分大小的主要是6,7-二甲氧基香豆素、7-羥基香豆素、槲皮素和橙皮苷4個性狀分量，其中6,7-二甲氧基香豆素是佛手藥材質量分級的最主要指標。決定第二主成分大小的主要是木犀草素和5,7-二甲氧基香豆素。因此，建議使用6,7-二甲氧基香豆素、7-羥基香豆素、槲皮素、橙皮苷、木犀草素和5,7-二甲氧基香豆素6個指標作為川佛手質量標準的評價指標，從而進一步彌補其藥典中單一橙皮苷成分進行質量檢測的不足。

本研究結果顯示，48份藥材樣品的橙皮苷含量都達到0.003%的《中國藥典》標準。不同產地川佛手藥材具有一定的差異性，其中5,7-二甲氧基香豆素和橙皮苷在樣品中含量較高，6,7-二甲氧基香豆素在樣品中含量較低。7-羥基香豆素含量最高的為四川省宜賓市長寧縣老翁鎮(26號樣品)；莨菪亭含量最高為四川省樂山市沐川縣高筍鄉(27號樣品)；阿魏酸含量最高為四川省樂山市犍為縣新民鎮(32號樣品)；6,7-二甲氧基香豆素含量最高為四川省宜賓市長寧縣老翁鎮(26號樣品)；橙皮苷含量最高為四川省石棉縣田灣鄉(35號樣品)；槲皮素含量最高為四川省宜賓市宜賓縣蕨溪鎮石坪村(21號樣品)；5,7-二甲氧基香豆素含量最高為四川省樂山市犍為縣新民鎮(32號樣品)；木犀草素含量最高為重慶市萬州區甘寧鎮(2號樣品)。

聚類分析是一種可將一組數據按照本身內在的規律較合理地分為幾類的探索性的分類方法，此方法可以大大縮小了以往全憑主觀判斷所造成的誤差，使數據分析結果客觀性更強[21]。本文以 8種化學成分的含量為指標對48個不同產地的川佛手樣品進行聚類分析，聚類分析結果將不同產地分為3類：29(四川省樂山市沐川縣新凡鄉)、35(四川省石棉縣田灣鄉)歸為一類，該類特征為橙皮苷含量較高；25、26、7、24、32、22、42、21、4、10、2、12歸為一類，該類樣品主要產自四川省宜賓市及重慶少部分地區，樣品特征為5,7-二甲氧基香豆素和木犀草素含量較高；其余產地歸為第三類，該類樣品主要產自四川大部分地區及重慶市云陽縣，樣品特征為各化學成分含量較平均。