四數九里香中的咔唑類生物堿成分及其細胞毒活性研究

周永福，陳鴻平，陳 林，劉友平 ，李 應

1成都中醫藥大學藥學院,成都 611137；2重慶工業職業技術學院化學與制藥工程學院,重慶 401120

九里香屬植物具有行氣止痛、活血化瘀之功效[1]；民族民間用于胃痛、風濕痹痛、外治牙痛、跌撲腫痛、蟲蛇咬傷[2]；主要含有咔巴唑生物堿、黃酮類、香豆素類等[3]。四數九里香(MurrayatetrameraHuang)主要分布于海南南部、廣西、云南南部一帶。在當地少數民族地區(彝族、壯族、苗族、傣族)以其干燥葉入藥。臨床上用于局部麻醉、降血糖[3]等。為了闡明其藥效與化學成分的相關性，我們對該植物藥做了系統研究。

我們采用冷浸漬法對采自于云南華寧的四數九里香進行冷浸、過濾、減壓蒸餾、得浸膏；使用硅膠層析柱、凝膠柱色譜、重結晶等方法對浸膏的乙酸乙酯萃取部分進行分離純化，運用1H NMR、13C NMR、HSQC、HMBC和ESI-MS等波譜方法和文獻數據對比，鑒定化合物結構。結果：從四數九里香的葉子中鑒定得到7個咔唑類生物堿、1個甾體類化合物：分別為β-谷甾醇(1)、1-甲基-3-丙?；沁?2)、1-甲氧基-3-乙基咔唑(3)、1-甲氧基-3-甲酰基咔唑(4)、1-甲氧基-3-甲基咔唑(5)、1-羧基甲酯-3-甲基咔唑(6)、1-羧基甲酯-3-乙基咔唑(7)、mananimbine(8)。除了化合物1、其他化合物為首次從該植物中分離得到，化合物2、3、4、5、7對SMMC-7721顯現良好的細胞毒活性。

1 儀器及材料

核磁共振儀(TMS為內標、瑞士bruker公司、400 MHz型)；柱色譜用硅膠GF254(200～300目、青島海洋化工公司)；Sephadex LH-20,ODS2A(50 μm,日本 日本YMC/維美希公司)；旋轉蒸發儀(河南省鞏義市予華儀器有限公司)；循環水式真空泵：SHZ-D(III)(河南省鞏義市予華儀器有限公司)；低溫冷卻循環泵(DLSB-5L/25、河南省鞏義市予華儀器有限公司)UtraScan ESI-MS(瑞士bruker公司)；二氧化碳培養箱(濟南鑫貝西生物技術有限公司)、多功能酶標分析儀(MULTISKAN FC)；乙醇、乙酸乙酯、石油醚、甲醇均為工業純，減壓蒸餾使用。

藥材于2016年2月采自云南省華寧縣,經成都中醫藥大學陳新博士鑒定為蕓香科九里香屬四數九里香MurrayatetrameraHuang的枝葉。植物標本(標本編號：20160122001)保存于重慶工業職業技術學院中醫藥物研究所；SMMC-7721細胞株購自于中國科學院昆明細胞庫。

2 提取與分離

四數九里香葉35 kg，晾干、粉碎、60%的乙醇溶液浸提(5×10.0 L×3)、濃縮、合并，得浸膏2.8 kg，溫水溶解、分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取、濃縮得石油醚萃取部分200 g；乙酸乙酯萃取部分680 g；正丁醇萃取部分460 g。

用硅膠色譜柱(200～300目、10 cm×150 cm)對乙酸乙酯萃取部分進行分離、分別用石油醚;乙酸乙酯(20∶1→18∶3→16∶5→14∶7→12∶9→10∶11→8∶13→6∶15→0∶21)為流動相進行洗脫，經TLC檢測后合并得39個組分：A1→A39。A1(80 g)經過混合溶劑(乙酸乙酯和丙酮)溶解、自然放置得針狀結晶、重結晶，得化合物1(45 g，展開劑為：石油醚：乙酸乙酯=20∶1，Rf=0.67)；A1余下部分經過硅膠柱色譜、使用環己烷：乙酸乙酯(30∶1→25∶6→20∶11→15∶16→10∶21)和乙酸乙酯為混合溶劑進行淋洗，得5個餾分：A1-1、A1-2、A1-3、A1-4、A1-5；A1-1(2.0 g)上凝膠色譜柱(2 cm×150 cm)，純化得化合物2(30.8 mg，環己烷：乙酸乙酯=10∶1，Rf=0.62)；A1-2(4.5 g)上正相硅膠柱子(2 cm×50 cm)，用環己烷：乙酸乙酯為15∶1淋洗、合并相同部位，自然放置，得晶體，為化合物3(53.65 mg、環己烷：乙酸乙酯=6∶1，Rf=0.72)；A1-3(5.0 g)上凝膠柱子(3 cm×120 cm)，分成三段：F1-3；F1進行薄層層析刮板，制得化合物4(6.8 mg，石油醚：乙酸乙酯=5∶1，Rf=0.78)、F2進行薄層層析刮板，得化合物5(13.4 mg，石油醚：乙酸乙酯=5∶1，Rf=0.51)、F3進行薄層層析刮板，得化合物6(21.1 mg，石油醚：乙酸乙酯=2∶1，Rf=0.76)；A1-4(7.0 g)，重復上正相，分為4餾分，各餾分上凝膠、合并相同部分，重結晶得化合物7、8。

3 結構鑒定

化合物1無色針晶(CHCl3)；1H NMR(400 MHz，CDCl3) δ:7.26(1H,s,-OH),5.35(3H,d,H-6),3.52(1H,dd,H-3),2.17(7H,s,H-8),1.84(7H,m,H-9),1.00(3H,s,H-19),0.92(3H,d,J=6.5 Hz,H-21),0.85(3H,d,J=7.0 Hz),0.83(3H,d,J=6.9 Hz),0.81(3H,d,J=6.8 Hz),0.68(3H,s,H-18);13C NMR(CDCl3,100 MHz) δ:12.01(C-18),12.11(C-26),18.90(C-19),19.04(C-29),19.41(C-21),19.83(C-28),21.09(C-25),23.07(C-15),24.31(C-22),26.07(C-12),27.23(C-27),28.26(C-8),29.16(C-7),31.67(C-2),31.92(C-1),33.95(C-23),36.16(C-20),36.51(C-10),37.26(C-16),39.78(C-4),42.32(C-24),45.84(C-13),50.14(C-9),56.06(C-17),56.78(C-14),71.79(C-3),121.72(C-6),140.77(C-5)。以上數據與文獻[4]報道一致，確定化合物為β-谷甾醇。

化合物2油狀(CHCl3)；1H NMR( 400 MHz,CDCl3) δ:8.03(1H,d,J=7.6 Hz,H-5),7.48(1H,d,J=7.6 Hz,H-8),7.36(1H,m,J=7.6 Hz,H-7),7.20(1H,dd,J=7.6 Hz,H-6),6.73(1H,s,H-2),2.15(3H,s,-CH3),1.25(2H,dd,-CH2-);13C NMR(CDCl3,100 MHz) δ:15.46(-CH3),27.06(-CH2-),29.72(-CH3),103.74(C-2),110.74(C-4),111.38(C-1),114.29(C-4a),116.68(C-8),117.85(C-4b),119.60(C-6),124.01(C-3),124.29(C-7),131.01(C-8b),138.87(C-8a),143.77(C-5),154.05(-C=O)。以上數據與文獻[5]一致，鑒定化合物為1-甲基-3-丙?；沁颉?/p>

化合物3油狀(CHCl3)；1H NMR( 400 MHz,CDCl3) δ:8.00(1H,d,J=8.00 Hz,H-5),7.44(1H,d,J=8.05 Hz,H-8),7.21(t,J=8.00 Hz,J=8.00 Hz,H-7),7.195(t,J=8.00 Hz,J=8.00 Hz,H-6),3.995(3H,s,-OCH3),1.529(3H,s,-CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz) δ:21.95(-CH3),29.72(-CH2-),55.48(-OCH3),107.65(C-7),110.90(C-8),112.50(C-4),119.14(C-6),120.46(C-5),123.51(C-3),124.29(C-4a),125.49(C-2),127.96(C-8a),129.45(C-4b),139.44(C-8b),145.32(C-1)。以上數據與文獻[6]一致，鑒定化合物為1-甲氧基-3-乙基咔唑。

化合物4油狀(CHCl3)；1H NMR( 400 MHz,CDCl3) δ：10.01(1H,s,-CHO),8.71(1H,s,H-N),8.17(1H,s,H-4),8.10(1H,d,J=8.0 Hz,H-5),7.51(1H,d,J=6.8 Hz,.H-8),7.477(1H,t,J=6.9 Hz,H-7),7.451(1H,s,H-2),7.33(1H,t,J=6.9 Hz,H-6),4.041(3H,s,H-OCH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz) δ:146.26(C-1),139.61(C-8b),130.13(C-3),123.83(C-4a),123.78(C-4b),139.64(C-8a),103.67(C-2),111.71(C-8),120.62(C-4),120.68(C-5),120.86(C-6),126.79(C-7),192.15(1-CHO),55.942(-OCH3)。以上數據與文獻[7]報道一致，故鑒定化合物為1-甲氧基-3-甲?；沁?。

化合物5油狀(CHCl3)；1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ:8.00(1H,d,J=8.00 Hz,H-5),7.44(1H,d,J=8.05 Hz,H-8),7.21(t,J=8.05 Hz,H-7),7.19(t,J=8.00 Hz,H-6),3.99(3H,s,-OCH3),1.53(3H,s,-CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz) δ:22.17(-CH3),55.57(-OCH3),107.92(C-7),111.20(C-8),112.86(C-4),119.66(C-6),120.65(C-5),123.59(C-3),124.57(C-4a),125.76(C-2),128.30(C-8a),129.68(C-4b),139.73(C-8b),145.54(C-1)。以上數據與文獻[8]一致，鑒定化合物為1-甲氧基-3-甲基咔唑。

化合物6油狀(CHCl3)；1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ:8.06(1H,d,J=7.6 Hz,H-5),7.58(1H,d,J=8.0 Hz,H-8),7.52(1H,s,H-2),7.38(1H,t,J=7.6 Hz,J=7.2 Hz,H-6),7.17(1H,t,J=8.0 Hz,J=7.2 Hz,H-7),6.85(1H,s,H-4),4.01(3H,s,-OCH3),2.52(3H,s,-CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz) δ:22.68(-CH3),56.53(-OCH3),109.21(C-7),112.83(d,C-8),113.85(m,C-4),120.17(m,C-6),121.65(m,C-5),124.82(d,C-3),125.75(C-4a),126.78(C-2),129.90(C-8a),130.31(C-4b),141.72(C-8b),147.32(C-1),178.98(C-1-C=O)。以上數據與文獻[9]一致，鑒定化合物為1-甲酸甲酯-3甲基咔唑。

化合物7油狀(CHCl3)；1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ:8.17(1H,d,J=7.6 Hz,H-5),8.13(1H,s,H-8),7.59(2H,m,J=8.0 Hz,J=8.4 Hz,H-2),7.35(2H,m,J=7.6 Hz,J=8.0 Hz,H-6,H-7),7.29(1H,d,J=7.6 Hz,J=8.0 Hz,H-3),4.62(2H,s,-OCH2-),4.21(3H,s,-OCH3),3.39(3H,s,-OCH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz) δ:58.75(-OCH3),65.18(N-OCH3),76.36(-O-CH2-),109.99(C-7),110.27(C-8),121.63(C-4),121.68(C-6),121.87(C-5),122.04(C-3),122.31(C-4a),128.11(C-2),128.36(C-8a),132.60(C-4b),139.23(C-8b),140.01(C-1).低分辨質譜顯示分子離子峰為m/z：241.012;分子式為：C15H15NO2,以上數據與文獻[10]一致，鑒定化合物為1-甲醚-9-甲氧基咔唑。

化合物8油狀(CHCl3)；1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ:7.94(1H,d,J=7.50 Hz),7.68(1H,s,H-4),7.41(3H,d,J=8.00 Hz,H-5),7.32(t,J=8.10 Hz),6.67(d,J=8.00 Hz,H-8),5.68(1H,d,J=9.8 Hz),4.02(2H,s,H-13),3.52(2H,s),2.55(1H,s),2.36(3H,s),2.20(3H,t),1.48(3H,s)；13C NMR(CDCl3,100MHz) δ:14.15(3-CH3),16.10(10-CH3),22.76(C-13),40.78(C-12),55.48(C-11),104.20(C-1),110.37(C-8),112.50(C-4a),116.61(C-9),117.54(C-3),118.43(C-5),119.20(C-6),121.25(C-4),123.93(C-5a),124.19(C-7),124.19(C-14),125.64(C-15),128.54(C-10),131.70(C-1a),139.45(C-8a),149.91(C-2)。低分辨質譜顯示m/z=307.26,[M+H]+,提示化合物分子式為：C21H25NO。以上數據與文獻[11]報道的數據基本一致，鑒定化合物為mananimbine。

4 細胞毒活性研究

用含10%胎牛血清的RMPI1640培養液配成單個細胞懸液，以每孔5 000 個細胞接種到96孔板，每孔體積100 μL，細胞提前12～24 h接種培養；化合物用DMSO溶解，以100、20、4、0.8、0.16 μg/mL濃度篩選肝癌細胞株SMMC-7721，每孔終體積200 μL，每種處理均設3個復孔。37 ℃條件下培養48 h后，棄孔內培養液；每孔加MTS溶液20 μL和培養液100 μL；設3個空白復孔(MTS溶液20 μL和培養液100 μL的混合液)，繼續孵育3 h，使反應充分進行；選擇492 nm波長，采用多功能酶標儀(MULTISKAN FC)讀取各孔光吸收值(A)，應用兩點法(Reed and Muench法)計算各化合物的IC50值[12]。

細胞抑制率=(A對照-A樣品)/(A對照-A空白)

每次實驗均設順鉑(DDP)和紫杉醇(Taxol)兩個陽性對照化合物，以濃度為橫坐標，細胞存活率為縱坐標繪制細胞生長曲線，應用兩點法(Reed and Muench法)計算化合物的IC50值。初步篩查結果見表1；結合初步篩查結果，以化合物編號為橫坐標，細胞抑制率為縱坐標，制得圖1?；衔锏腎C50值見表2。

表1化合物1～8的肝癌細胞株(SMMC-7721)毒活性初步測試結果

Table 1 The cytotoxic activity of compound1-8(Preliminary test result)

化合物CompoundSMMC-7721細胞毒活性SMMC-7721 cell inhibition(%)AverageSD順鉑DDP65.72 10.00 紫杉醇Taxol13.17 1.25 12.40 3.32 297.86 0.72 399.04 0.53 499.43 0.31 599.70 0.21 641.62 2.14 795.83 2.02 84.22 1.34

注：與順鉑(DDP)和紫杉醇(Taxol)兩個陽性化合物比較。

Note:Compare with DDP and Taxol.

在100 μg/mL濃度下，單體化合物對肝癌細胞株毒活性初步測試結果見表1；從表1中明顯看到：與陽性化合物對比，化合物2～5、7對肝癌SMMC-7721的體外腫瘤生長有半數抑制活性。

以化合物對SMMC-7721細胞的體外腫瘤生長有半數抑制活性為篩選基礎，進一步分析測試化合物2～5、7的細胞毒活性IC50值。測試結果見表2。

化合物2～5、7的IC50值表明：與陽性對照物比較，化合物2～5、7對肝癌細胞株SMMC-7721顯現了很好的細胞毒活性。

5 結論

九里香屬植物四數九里香MurrayatetrameraHuang具有抗炎癥，抗生育、抗甲狀腺等作用。本實驗通過色譜技術從中分離制得8個單體化合物，采用現代波譜分析方法鑒定了它們的結構，分別為7個咔唑類生物堿和1個甾體化合物；并以肝癌細胞株(SMMC-7721)為細胞模型，分別對這8個化合物做了細胞毒實驗初步篩選和復選，研究表明：化合物2～5、7對肝癌細胞株SMMC-7721顯現了很好的細胞毒活性。該研究結果為四數九里香抗肝癌活性提供了數據和理論支持，為進一步研究開發民族民間藥物四數九里香和相關的抗肝癌新藥提供了堅實的基礎。

表2化合物2～5、7的肝癌細胞株毒活性測試結果(IC50)

Table 2 The SMMC-7721 cytotoxic activity of compound2-5,7(IC50)

化合物CompoundSMMC-7721IC50±SD(μM)順鉑DDP21.13±1.22紫杉醇Taxol<0.008240.93±0.66346.03±2.054114.21±5.67515.79±0.997185.1±0.44