藏藥波棱瓜子中酚性成分的研究

戴宇軒，胡 沙，蔣合眾，譚 睿，2*

1西南交通大學生命科學與工程學院；2西南交通大學醫學院，成都 610031

藏藥波棱瓜子，又名色吉美多，系葫蘆科植物波棱瓜Herpetospermumcaudigerum(Wall.)的成熟干燥種子。主要產于中國西南(四川、云南、西藏)及印度等地區，常生長在海拔2 300～3 500 m的山坡灌叢、林緣及路旁[1]。為藏醫常用藥，性寒，味苦，具瀉肝火、膽熱、解毒的功效，用于治療“赤巴”引起的黃疸、肝炎、消化不良及肝膽疾病的配方[2]。近年來，國內外有關波棱瓜子的化學成分報道表明其含有脂肪酸類、木脂素類、氨基酸和多糖類等成分[3]。本課題組通過前期的研究成果表明，波棱瓜子乙酸乙酯部位對乙肝病毒有明顯的抑制作用[4]。為了進一步揭示其中的活性成分，本文對波棱瓜子乙酸乙酯部位酚性成分進行了分離研究，并對分離得到的單體化合物進行了抗菌活性測試，為后期進一步的藥理實驗提供重要參考。

1 儀器與試劑

Bruker DRX 400核磁共振儀；電子天平；EYELA旋轉蒸發儀；冷卻循環裝置；Agilent 6210 TOF LC-MS質譜儀。TH-3560立式高壓滅菌鍋、Leica多功能顯微鏡、接種環、電子天平、移液槍、超凈工作臺、恒溫搖床、恒溫培養箱、恒溫培養室、96孔微孔稀釋板等。柱層析所用硅膠(200～300目、300～400目)由青島海洋化工廠生產；Sephadex LH-20購買自瑞典Pharmacia Biotech；TLC層析板(0.15～0.2 mm)為煙臺市芝罘黃務硅膠開發公司生產。其余試劑為分析純。

波棱瓜子藥材購買于四川省瀘定縣，經西南交通大學生命科學與工程學院宋良科副教授鑒定為波棱瓜Herpetospermumcaudigerum(Wall.)的干燥種子，標本部分留樣保存于西南交通大學生命科學與工程學院3704實驗室。

2 提取與分離

取10 kg波棱瓜子的干燥種子粉碎成粗粉，用95%乙醇對粗粉進行滲漉提取，合并濾液，減壓回收溶劑，將總浸膏用水分散，依次加入石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進行萃取3到4次，分別減壓濃縮得到石油醚部位浸膏重約217 g，乙酸乙酯部位浸膏重約208 g，正丁醇部位重約107 g。

乙酸乙酯部位進行除糖除脂處理后，取146 g浸膏進行硅膠柱層析，以三氯甲烷-甲醇(100∶1～1∶1)體系洗脫，并以TLC檢測判斷合并，最終粗分為9個組分(Fr.1～Fr.9)。

取Fr.4(32 g)進行硅膠柱層析，以石油醚-丙酮(40∶1～1∶1)的系統進行梯度洗脫，依據TLC檢測，合并成8個組分(Fr.4-1～ Fr.4-8)。選取Fr.4-1(7.3 g)，繼續硅膠柱層析，最后反復進行Sephadex LH-20凝膠柱層析，洗脫劑分別采用三氯甲烷-甲醇(1∶1)、純甲醇，最終分離得到化合物1(12.8 mg)。

選取Fr.4-7(6.6 g)進行硅膠柱層析，以石油醚-丙酮(40∶1～0∶1)梯度洗脫。TLC鑒別合并后，選取Fr.4-7-1(1.2 g)，采用Sephadex LH-20凝膠柱層析進一步純化(洗脫劑：純甲醇)，之后反復進行硅膠柱層析，最終得到化合物2(17.4 mg)。將Fr.4-7-3(1.8 g)進行硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯(50∶1～0∶1)梯度洗脫，經TLC檢測合并后得到6個組分(Fr.4-7-3-1～ Fr.4-7-3-6)。選取Fr.4-7-3-2經Sephadex LH-20凝膠柱層析，洗脫系統為三氯甲烷-甲醇(1∶1)，得到化合物6(10.8 mg)。再將Fr.4-7-3-4反復經凝膠柱分離純化，洗脫系統依次為三氯甲烷-甲醇(1∶1)，純甲醇，最終得到化合物7(9.6 mg)。另取Fr.4-7-5(2.3 g)凝膠柱層析，三氯甲烷-甲醇(1∶1)為洗脫劑分離合并后取Fr.4-7-5-4(45 mg)，再次采用凝膠柱層析(純甲醇)分離得到白色粉末狀固體，即為化合物3(11.5 mg)。

取Fr.4-8(4.9 g)以石油醚-乙酸乙酯(20∶1～0∶1)梯度洗脫，分離得到5個組分。其中Fr.4-8-3反復經過Sephadex LH-20凝膠柱層析，洗脫系統依次為：三氯甲烷-甲醇(1∶1)，純甲醇，最終得到化合物4(20.2 mg)。將Fr.4-8-1經凝膠柱層析(洗脫劑：純甲醇)得到單體化合物5(10.7 mg)。

3 結構的鑒定

化合物1無色油狀物(C20H20O6)；HR-ESI-MSm/z379.1174 [M+Na]+；1H NMR (400 MHz,Acetone-d6)δ:7.54 (1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),7.42 (1H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-6′),7.33 (1H,d,J=1.2 Hz,H-2),7.03 (1H,d,J=1.2 Hz,H-6),6.99 (1H,d,J=8.2 Hz,H-5′),6.69 (1H,dt,J=15.8,1.4 Hz,H-7),6.41 (1H,dt,J=15.8,5.4 Hz,H-8),4.87 (2H,d,J=5.4 Hz,H-9′),4.25 (2H,dd,J=5.4,1.1 Hz,H-9),4.04 (3H,s,-OMe),3.94 (3H,s,-OMe)。通過對比已知化合物的物理數據以及波譜數據，與文獻[5]對比一致，故確定其為木脂素二聚體(herpetol )。

化合物2白色無定形粉末(C16H14O6)；HR-ESI-MSm/z325.0674 [M+Na]+；1H NMR (400 MHz,Chloroform-d)δ:8.12 (1H,s,H-1′),7.89 (1H,s,H-4′),6.93 (1H,d,J=2.8 Hz,H-6),6.88 (1H,d,J=2.8 Hz,H-8),5.83 (1H,s,-CH2OH),5.01 (2H,d,J=6.0 Hz,-CH2-),4.09 (3H,s,2′-OMe),3.87 (3H,s,7-OMe)。通過對比已知化合物的物理數據以及波譜數據，以上數據與文獻[6]對比基本一致，故確定其為波棱內酯 A(herpetolide A)。

化合物3無色油狀物(C20H24O7)；HR-ESI-MSm/z399.1417 [M+Na]+；1H NMR (400 MHz,Acetone-d6)δ: 7.56 (1H,s,-OH),7.04 (1H,d,J=1.8 Hz,H-2′),7.00 (1H,d,J=1.7 Hz,H-2),6.84 (1H,dd,J=8.1,1.8 Hz,H-6′),6.83 (1H,d,J=8.1,1.8 Hz,H-6),6.79 (1H,d,J=8.1 Hz,H-5),6.78 (1H,d,J=8.1 Hz,H-5′),4.47 (1H,d,J=9.0 Hz,H-7′),4.44 (2H,d,J=9.0 Hz,H-9),3.85 (3H,s,-OMe),3.84 (3H,s,-OMe),3.67 (2H,dd,J=9.0,7.1 Hz,H-9′),3.62 (1H,m,H-8),3.51 (1H,t,J=8.6 Hz,H-8′),2.59 (1H,m,H-7),2.24 (1H,m,H-7)。通過對比已知化合物的物理數據以及波譜數據，與文獻[7]對比一致，故確定其為(9R)-9-羥基落葉松脂醇[(9R)-9-hydroxylariciresinol ]。

化合物4淡黃色油狀物(C17H18O6)；HR-ESI-MSm/z341.0962 [M+Na]+；1H NMR (400 MHz,Acetone-d6)δ: 7.66 (1H,dd,J=8.3,2.0 Hz,H-6),7.59 (1H,d,J=2.0 Hz,H-2),6.99 (1H,d,J=1.9 Hz,H-2′),6.85 (1H,d,J=8.3 Hz,H-5),6.80 (1H,dd,J=8.1,1.9 Hz,H-6′),6.74 (1H,d,J=8.1 Hz,H-5′),4.82 (1H,dd,J=8.6,5.2 Hz,H-8),4.24 (1H,dd,J=10.4,8.8 Hz,H-9),3.87 (3H,s,-OMe),3.81 (3H,s,-OMe),3.70 (1H,dd,J=10.5,5.2 Hz,H-9)。通過對比已知化合物的物理數據以及波譜數據，與文獻[8]對比一致，故確定其為楝葉吳萸素 B(evofolin-B)。

化合物5淡黃色油狀物(C27H30O14)；HR-ESI-MSm/z601.1526 [M+Na]+；1H NMR (400 MHz,Acetone-d6)δ: 12.69 (1H,s,-OH),7.89 (1H,d,J=8.8Hz,H-2′),7.89 (1H,d,J=8.8 Hz,H-6′),7.03 (1H,d,J=8.8 Hz,H-3′),7.03 (1H,d,J=8.8 Hz,H-5′),6.78 (1H,d,J=2.1 Hz,H-8),6.47 (1H,d,J=2.1 Hz,H-6),5.64 (1H,d,J=1.4 Hz),5.54 (1H,d,J=1.4 Hz),4.22 (1H,br s),4.05 (1H,br s),3.84 (1H,d,J=3.2 Hz),3.70 (1H,m),3.60 (1H,m),3.50 (1H,m),3.34 (1H,m),1.22 (3H,d,J=6.1 Hz),0.90 (3H,d,J=5.7 Hz)。通過對比已知化合物的物理數據以及波譜數據，與文獻[9，10]對比一致，故確定其為山奈苷(kaempferol 3,7-O-α-L-dirhamnoside)。

化合物6白色無定型粉末(C30H34O9)；HR-ESI-MSm/z561.2116 [M+Na]+；1H NMR (400 MHz,Acetone-d6)δ:7.63 (1H,s,4-OH),7.46 (1H,s,3"-OH),7.04 (1H,d,J=1.8 Hz,H-2),6.94 (1H,d,J=1.5 Hz,H-2"),6.89 (1H,dd,J=8.2,1.8 Hz,H-6),6.80 (1H,d,J =8.1 Hz,H-5),6.76～6.78 (3H,m,H-6′,5",6"),6.74 (1H,br s,H-2′),5.52 (1H,d,J=6.7 Hz,H-7),4.78 (1H,d,J=6.2 Hz,H-7"),4.12 (1H,m,H-9′),3.97 (1H,dd,J=8.6,6.2 Hz,H-9′),3.85 (2H,m,H-9"),3.83 (3H,s,3-OMe),3.81 (6H,s,3′,4"-OMe),3.68 (1H,dd,J=8.0,6.8 Hz,H-9),3.52 (1H,dd,J=12.6,6.5 Hz,H-8"),2.97 (1H,m,H-7′),2.71 (1H,m,H-8),2.55 (1H,m,H-7′),2.31 (1H,m,H-8′)。根據以上波譜數據與文獻[12]的對照，信息基本一致，故確定其為波棱素(herpetin)。

化合物7無色油狀物C30H32O10；HR-ESI-MSm/z575.1858 [M+Na]+；1H NMR (400 MHz,Chloroform-d)δ:7.60 (1H,dd,J=8.3,1.8 Hz,H-6),7.58 (1H,d,J=1.8 Hz,H-2),6.87 (1H,d,J=8.3 Hz,H-5),6.87 (1H,d,J=1.8 Hz,H-2′′),6.81(1H,d,J=8.2 Hz,H-5′′),6.77～6.79 (2H,m,H-2′,6′′),6.60 (1H,d,J=1.5 Hz,H-6′),5.20 (1H,dd,J=8.1,4.6 Hz,-CH2OH),4.68 (1H,d,J=5.1 Hz,H-7′),4.59 (1H,d,J=5.1 Hz,H-7′′),4.13～4.24 (3H,m,H-9,9′,9′′),3.89 (6H,s,3,3′-OMe),3.87 (3H,s,3′′-OMe),3.77～3.86 (3H,m,H-8,9′,9′′),2.93～3.07 (2H,m,H-8′,8′′)。與文獻[13]對比基本一致，故確定其為木脂素三聚體(herpetrione)。

圖1 化合物1～7的化學結構Fig.1 The chemical structures of compounds 1-7

4 活性測試

4.1 抗菌活性研究

使用鑷子夾取牙簽(已滅菌)挑取平板上的單菌落，并置于已滅菌的液體Mueller-Hinton培養基中，在35 ℃搖床中培養過夜，隨后將80～500 μL菌液轉接至新液體培養基中，用同樣的方法培養2～6 h；將菌液稀釋至麥氏標準0.5，并用無菌水稀釋20倍，用排槍在96孔板中每個孔加20 μL，隨后將化合物先后溶解于50 μL DMSO、無菌水中，配成10 μM濃度的藥液，并在微孔中加入50 μL的無菌水，采用二倍稀釋法稀釋成一定梯度濃度。在96孔板中加入梯度濃度的藥液，待微孔稀釋板振蕩混合后，在35 ℃搖床中培養16～20 h；最后，于有黑色背景光源處觀察實驗結果，有菌生長的孔底部有扣子樣沉淀或呈現出彌漫型渾濁，無菌生長的孔所含的最低樣品濃度即為該樣品的最小抑菌濃度MIC[14,15]。

4.2 活性測試結果

對所分離得到的7個單體化合物進行了抗菌活性實驗，以鏈霉素為陽性對照，結果如下(見表1)：在10 μM的濃度下，除化合物6和7對白色念珠菌(CandidaalbicansATCC 14053)具有一定的抑制活性外，其余大部分單體化合物對白色念珠菌，新型隱球酵母(CryptococcusneoformansACCC 20337)，枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisCICC 10285)和恥垢分枝桿菌(MycobacteriumsmegmatisCGMCC 1.562)并沒有表現出良好的抑制活性。

表1 部分化合物的抗菌活性測試結果

注：MIC代表最低抑制濃度；“+”表示具有較好的抑制活性；“-”表示測試濃度(10 μM)下沒有顯著的抑制活性。

Note:MIC represents minimum inhibition concentration;“+” shows good inhibitory activity;“-” shows no significant inhibitory activity (Concentration:10 μM).

5 討論

作為藏藥常用藥，波棱瓜子具有較好的藥理活性和療效[3] [11]，但其藥理活性的報道主要還是以其粗提物或不同的極性部位為主，其單體化合物藥理活性的研究報道較少，因此從波棱瓜子中獲得單體化合物，豐富天然產物的類型，并進行活性研究是闡明其藥用價值的關鍵。本實驗從波棱瓜子乙酸乙酯部位分離得到7個酚性成分，其中包括6個木脂素類、1個黃酮苷類化合物，抗菌活性實驗結果表明，波棱瓜子中木脂素類成分Herpetin(6)和Herpetrione(7)有可能是波棱瓜子具有抗白色念珠菌活性的藥效物質基礎之一，但這些化合物抗白色念珠菌活性的作用機制還需要做進一步探討。同時，波棱瓜子乙酸乙酯部位可能還有更多木脂素類和黃酮苷類化學成分未被發現或報道，存在一定的研究價值，能夠為波棱瓜子化學成分和藥理活性的深入研究提供重要參考，從而進一步促進其研究與開發。

致謝：南京大學醫藥生物技術國家重點實驗室功能生物分子研究所測試所有波譜數據，同時，特別感謝南京大學生命科學學院碩士研究生張雯景和鄧欣召在活性測試方面給予的幫助。