雪松松針多糖超聲波酶法提取及其抗氧化性

周思杰，張智紅，段久芳,2，蔣建新,2，朱莉偉,2*

1北京林業大學材料科學與技術學院；2林業生物質材料與能源教育部工程研究中心，北京 100083

雪松是松科Pianaceae植物雪松屬Cedrus Trew樹種的統稱，在中國長江流域各大城市廣泛種植，被作為城市環境大氣污染的指示植物。雪松不僅具有觀賞價值，也具有較突出的藥用價值，其針葉為13個可供藥用的松針之一[1]。松針是松樹藥用的代表部位，其作為松類植物的主要副產物，具有采收便捷、分布廣泛、天然蓄積量大等特點，是一種豐富的天然再生資源。在我國古代就有用松針來治療疾病的記載，其不但含有豐富的生物黃酮類、揮發油類物質，還富含脂肪酸、葉綠素、維生素等[2]。現代研究表明，松針提取物具有抗炎鎮痛、抗氧化、抗驚厥、抗糖尿病、抗癌抑菌等多種藥理活性[3，4]，其研究開發日益受到重視。隨著松針提取物產業的發展，松針藥用活性成分在市場上形成了系列產品，但松針醇提后的殘渣未得到有效利用，其中含有豐富的植物多糖。

近年來大量研究表明，植物多糖是一種具有多種生理功能和開發價值的活性多糖，對人體有獨特的保健功效，許多植物多糖具有提高免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗感染、抗潰瘍等多種生理功能[5，6]。目前，已有相關文獻研究了松針多糖的提取工藝，葛霞[7]等人采用水提法提取雪松松針多糖，正交優化后最高得率為4.91%；許小向[8，9]等人采用超聲波輔助熱水浸提火炬松松針多糖，響應面法優化后最高得率為1.87%，采用微波輔助法提取馬尾松松針多糖，正交優化后最高得率為2.17%。但使用超聲波酶法提取松針多糖工藝的研究以及松針多糖的結構分析還未見報道。

本研究采用超聲波酶法從雪松松針中提取多糖，在單因素基礎上采用響應面分析法對其提取工藝進行優化，通過現代儀器表征了多糖結構，并測定其體外抗氧化活性，以期為松針多糖的高值化利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雪松(Cedrusdeodara)松針，4月份采摘于北京林業大學校園內的成年雪松，經北京林業大學林木育種國家工程實驗室康向陽教授鑒定。

菠蘿蛋白酶(120萬 U/g) 南京東恒華道公司；纖維素酶(160 FPU/mL) 諾維信(中國)公司；1，1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)標準品、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、果糖、甘露糖標準品 SIGMA公司；半乳糖醛酸標準品 Fluka公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒 北京鼎國昌盛公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

BILON-1000CT型多用途恒溫超聲波提取機，上海比朗公司；UV-6100A型紫外-可見分光光度計，上海比朗公司；318C+酶標儀，上海歐沛公司；Bruker-ALPHA傅里葉變換紅外，美國Bruker公司；Waters 2695 高效液相色譜(配有Aminex HPX-87P柱子，Sugar Park I柱和2414 RID示差折光檢測器)，美國Waters公司；Bruker UltrashieldTM 400 PLUS核磁共振分析儀，美國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 松針預處理及提取方法預實驗

將采摘的雪松松針除雜、清洗、干燥、粉碎，過40 目篩，石油醚和無水乙醇抽提，氣干后得預處理松針粉末，測定含水率后密封，備用。

首先進行提取方法的預實驗，比較U法(超聲不加酶提取)、EU法(加酶后超聲提取)、UE法(超聲后加酶提取)三種方法對多糖得率的影響。

超聲提取條件：稱取3.0 g預處理松針粉末，按液料比30∶1(mL∶g)，pH5.0，溫度80 ℃，功率300 W，超聲處理30 min。酶處理條件：纖維素酶用量為12 FPU/g原料，50 ℃ 振蕩2 h，滅酶20 min。后續操作：將多糖提取液離心，殘渣用水二次提取，合并清液，濃縮，醇沉，4 ℃靜置12 h，離心，沉淀依次用無水乙醇、乙醚、丙酮洗滌[10]，凍干后得松針粗多糖。

測得三種方法多糖得率分別為5.73%、7.27%和8.23%，表明超聲結合酶處理可以提高多糖的得率，并且UE法效果最好，所以采用超聲波酶法進行后續工藝優化研究。

1.3.2 葡萄糖標準曲線制作和多糖得率的測定

采用苯酚硫酸法制作標準曲線[11]。以糖液質量濃度X為橫坐標(單位mg/L)，吸光度A為縱坐標，通過線性回歸求出方程A= 0.005 7X-0.075 5(R2=0.995)。將提取的粗多糖配成1 mg/mL的糖液，稀釋一定倍數后同樣采用苯酚硫酸法測其吸光度(A)，測定粗多糖純度，進一步用下列公式計算多糖得率。

式中：m1—預處理松針粉的絕干質量，g；m2—提取的粗多糖質量，g；n—稀釋倍數。

1.3.3 單因素試驗

按1.3.1節中的超聲波酶法，依次比較超聲溫度(65、70、75、80 ℃)、超聲時間(15、30、45、60 min)、超聲功率(200、400、500、600 W)和液料比(20∶1、30∶1、40∶1和50∶1)(mL∶g下同)的條件下單因素對松針多糖得率的影響。

1.3.4 響應面分析工藝優化

在單因素試驗基礎上，利用Design Expert 8.0.6.1軟件中Box-Behnken設計方法對超聲波酶法提取松針多糖工藝進行優化，對超聲溫度、超聲時間、超聲功率這三個因素進行響應面優化試驗設計，并對試驗數據進行二次多項回歸擬合。以多糖得率為響應值，比較三個自變量對多糖得率影響的顯著性，優選出提取的最佳工藝條件。按最佳工藝條件驗證三次，將得率與預測值進行對比。

1.3.5 粗多糖的純化

采用酶法與Sevage法聯用的方法來脫蛋白[12]。調節糖液pH至7.0左右，加入粗多糖質量0.1%～0.5%的菠蘿蛋白酶，53 ℃，振蕩1 h。滅酶后加入Sevage試劑，劇烈振蕩30 min，靜置分層，取上層清液，按上述方法重復處理2次。

采用雙氧水與活性炭聯用的方法脫除色素。將脫除蛋白的糖液pH調至9.0左右，加入3%過氧化氫和5%的活性炭，50 ℃，振蕩1 h。過濾、濃縮后移入分子截留量為3 500的透析袋中，流動的自來水和蒸餾水中各透析兩天，凍干后得到純化多糖。

1.3.6 多糖結構初步表征

將純化多糖樣品配成一定濃度的溶液，在波長200～800 nm范圍進行紫外可見光全波長掃描，檢測其有無核酸、多肽、蛋白吸收。

稱取干燥純化多糖2 mg，加200 mg KBr，研磨，壓片，在4 000～400 cm-1的波數范圍內進行紅外光譜掃描，繪制紅外光譜圖，分析其主要官能團。

取適量純化多糖溶解于氘水中，并加入一滴氫氧化鈉溶液振蕩使其形成透明均勻溶液后，裝入干燥、潔凈的核磁管中，放入核磁共振儀中進行一維氫譜分析[13]。

1.3.7 單糖組分分析

分別準確稱取適量粗多糖和純化多糖，按1∶4體積比加入1M H2SO4，100 ℃，封管水解1 h，冷卻中和，離心，上清液用0.22 um濾器過濾，濾液高效液相色譜檢測[14]。

色譜條件：柱溫為85 ℃，檢測器溫度為35 ℃，進樣量為10 uL，流動相為雙蒸水，流速為0.6 mL/min。

采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定粗多糖和純化多糖中的蛋白質含量的測定。

分別準確稱取適量粗多糖和純化多糖，用純凈水配制質量濃度為3～5 mg/mL的溶液，參考文獻方法[15]，采用HPLC檢測糖醛酸含量。

1.3.8 松針多糖的體外抗氧化性

采用1,10-菲羅啉-Fe2+氧化法，測定松針粗多糖和純化多糖對Fenton反應產生的羥自由基(·OH)的清除能力[16]。其中A0是不存在H2O2和樣品的對照吸光度，A1是沒有樣品但存在H2O2的對照吸光度，A2是樣品的吸光度，平行測定三次，取平均值，以Vc作陽性對照。清除率計算公式為：

參考文獻[17]測定松針粗多糖和純化多糖對DPPH·的清除能力，并以Vc作陽性對照。清除率計算公式為：

式中：A0—2 mL去離子水+2 mL DPPH醇溶液的吸光度值；A1—2 mL多糖樣品+2 mL DPPH醇溶液的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 單因素對松針多糖得率的影響

在液料比30∶1，超聲功率400 W，超聲時間30 min，纖維素酶用量為12 FPU/g原料條件下，研究超聲溫度對多糖得率的影響。由圖1(a)可知：在65～80 ℃范圍內，隨超聲溫度的升高多糖得率呈現先升后降的趨勢。這是因為高溫可以加快多糖的溶出；但溫度過高會導致多糖的部分降解，故最佳提取溫度選擇75 ℃。

超聲溫度為75 ℃時，研究超聲時間對多糖得率的影響。如圖1(b)所示：隨著超聲提取時間的延長，多糖得率逐漸提高，在60 min時達到最大。但是考慮到超聲時間過長容易造成多糖結構的破壞，故最佳提取時間選擇60 min。

超聲溫度為75 ℃，時間為60 min時，研究超聲功率對多糖得率的影響。如圖1(c)所示：在超聲功率200～600 W的范圍內，松針多糖得率呈先增后降的趨勢。超聲功率增大有助于多糖溶解，但大于500 W時，會對多糖結構造成破壞，發生降解，使多糖得率下降，故最佳超聲功率選擇500 W。

超聲溫度為75 ℃，時間為60 min，功率為500 W時，研究液料比對多糖得率的影響。如圖1(d)所示：隨著液料比的加大，多糖得率呈小幅下降的趨勢，故最佳液料比確定為20∶1(mL∶g)。

2.2 響應面分析法對雪松松針多糖提取工藝的優化

2.2.1 響應面法試驗設計及結果

在單因素試驗基礎上，以對超聲波酶法提取雪松松針多糖得率影響效果顯著的3個因素—超聲溫度、超聲時間和超聲功率為自變量，多糖得率為響應值Y，采用Box-Behnken設計模型進行三因素三水平響應面分析。試驗設計及結果如表1所示。

圖1 提取的單因素試驗Fig.1 Simple factor experiments on extraction

表1 響應面試驗設計及結果

通過Design Expert 8.0.6.1軟件對各因素進行二次響應面回歸分析，得出多元二次響應面回歸擬合模型為：

Y=-27.683 5+1.021A+0.116 2B-0.0240 75C+0.001 066 67AB+0.000 68AC-0.000 016 6667BC-0.008 92A2-0.002 035 56B2-0.000 026 3C2。

該模型的方差分析結果見表2。

表2 方差分析表

注：***差異極顯著P<0.000 1；**差異高度顯著 0.000 1

Note:***extremely significant differenceP<0.000 1;**highly significant difference 0.000 1

2.2.2 最優工藝參數的確定

通過對所得回歸模型的分析，確定雪松松針多糖最佳提取條件為：超聲溫度80 ℃，超聲功率561.66 W，超聲時間47.17 min，在此條件下模型預測松針多糖提取得率為10.18%。為了給實際操作帶來方便，修正最佳工藝條件為：提取溫度80 ℃，超聲功率560 W，超聲時間47 min，且在此條件下進行3次驗證實驗，平均得率為10.39%，與模型預測值的相對誤差為2.06%，實際值與理論值基本相符，說明優化后的工藝條件準確可靠，具有一定的應用價值。

2.3 松針多糖結構初步表征結果

2.3.1 紫外可見光掃譜和紅外光譜分析

純化多糖光譜圖中波長260 nm和280 nm處未發現明顯的吸收峰，表明其中不含核酸，并且多肽和游離蛋白等物質含量較低。

圖2是雪松松針純化多糖的紅外圖譜，3 400～3 300 cm-1處的寬峰是由多糖分子中O-H的伸縮振動產生，2 925 cm-1處的吸收峰是由-CH2-或-CH3的C-H鍵的伸縮振動產生，它們是多糖物質的特征吸收峰。1 620 cm-1處的吸收峰可能由-CHCOONH3基團中C=O的非對稱伸縮振動產生，1 400 cm-1處的吸收峰也可能是由-COOH中C-O的伸縮振動產生，說明純化的多糖中可能存在少量蛋白質或多酚。此外1 030 cm-1,1 152 cm-1處的一組強烈吸收峰是吡喃環中C-O-C和C-O-H的吸收，944 cm-1和762 cm-1處的吸收峰分別是由D-葡萄吡喃糖的C-O-C骨架非對稱和對稱伸縮振動產生，而呋喃糖相應的峰出現在944 cm-1和853 cm-1，880 cm-1為β-吡喃糖苷鍵的特征吸收峰。因此雪松松針純化多糖中可能同時含有吡喃糖和呋喃糖，并且以β-糖苷鍵為主要連接方式。

圖2 雪松松針純化多糖的紅外光譜Fig.2 Infrared spectrum of pine needles purified polysaccharides

2.3.2 純化多糖1H NMR分析

從圖3中可以觀察到松針多糖的異頭質子產生的信號集中出現在δ4.64～4.99 ppm的范圍內，表明雪松松針多糖具有β構型的糖苷鍵，該結果與紅外譜圖中對糖苷鍵構型判斷是一致的。異頭氫質的化學位移處于較低場，一般在4.5～5.5 ppm的區域內有幾個質子信號，即表示有幾種單糖組分。1H-NMR譜表明有4個主要的異頭質子信號：δ4.99，δ4.93，δ4.76，δ4.64，初步推斷松針多糖有4種單糖組分。

圖3 松針純化多糖的1H NMRFig.3 1H NMR spectrum of pine needles purified polysaccharides

2.3.3 多糖組成分析

從表3中的結果可知，雪松松針粗多糖中含有葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、果糖和甘露糖5種單糖，多糖的純度為60.31%，其中還含有28.97%的半乳糖醛酸和10.46%蛋白質。純化多糖中甘露糖未檢測出，只含有其余4種單糖，多糖的純度為91.23%，其次還有質量百分濃度分別為2.41%的半乳糖醛酸和5.40%的蛋白質。這說明經純化處理后，粗多糖中的蛋白質、色素等雜質脫除接近一半，同時因為在堿性條件下采用H2O2脫色，半乳糖醛酸發生失穩現象，主鏈解聚，變成了可溶性小分子物質，在透析時流失，因此純化多糖中的半乳糖醛酸含量大幅度降低。此外甘露糖作為中性糖可能處于半乳糖醛酸支鏈上，隨半乳糖醛酸主鏈斷裂也流失了，純化多糖中不含有甘露糖，其余4種單糖的質量濃度大小為：葡萄糖>果糖>阿拉伯糖≈半乳糖，摩爾比約為23.02∶5.40∶1.22∶1.00，該結果與核磁共振氫譜的結果一致。

表3 多糖組成分析結果

2.4 松針多糖的抗氧化性試驗結果

2.4.1 清除羥自由基(·OH)的能力

由圖4(a)可知：在0.1～1.4(g/L) 的濃度范圍內，Vc和松針粗多糖對·OH的清除率隨濃度的增大而不斷增大，呈現一定的量效關系。Vc對羥自由基的清除率在0.6 g/L達100%，粗多糖在1.4 g/L達100%，它對羥自由基的半抑制濃度IC50為0.47 g/L，說明雪松松針粗多糖對羥自由基有較好的清除能力。但純化多糖對·OH的清除率保持在25%左右，并不隨濃度的增大產生較明顯的變化，在1.4 g/L時僅為26.50%，粗多糖對羥自由基的清除能力遠高于純化多糖。

2.4.2 清除DPPH·自由基的能力

由圖4(b)可知：在0.1～1.4(g/L)的濃度范圍內，松針粗多糖和純化多糖二者對DPPH·的清除率隨濃度的增大而不斷增大，均呈現一定的量效關系，且粗多糖清除DPPH·的能力遠遠強于純化多糖。Vc對DPPH·的清除率在0.1 g/L達到90%以上，粗多糖在0.4 g/L時也可以達到90%，它對DPPH·的半抑制濃度IC50為0.076 g/L；但是純化多糖對DPPH·的清除率在1.4 g/L時僅為27.71%，粗多糖對DPPH·的清除能力遠高于純化多糖，并且與對羥基自由基的清除結果一致。這與茶葉多糖非常類似，茶葉多糖的抗氧化活性與其糖醛酸含量呈正相關,糖醛酸含量越高,其抗氧化能力越強[18]，雪松松針粗多糖中的半乳糖醛酸質量濃度高于純化多糖，因此粗多糖的抗氧化性要明顯優于純化多糖。松針多糖的抗氧化能力可能主要取決于其中的半乳糖醛酸含量或者是多糖半乳糖醛酸復合物協同作用的結果。

圖4 松針多糖的抗氧化活性Fig.4 Antioxidant activities of pine needle polysaccharides and Vc

3 結論

研究采用超聲波酶法從雪松松針中提取多糖，在單因素試驗基礎上，采用響應面分析法對提取工藝進行優化，獲得最佳工藝為：3.0 g松針粉末，液料比20∶1(mL∶g)，提取溫度80 ℃，超聲功率560 W，超聲時間47 min，纖維素酶用量12 FPU/g原料，在此條件下多糖得率高達10.39%。通過測定松針多糖對·OH和DPPH·自由基的清除能力評價其體外抗氧化活性，結果表明：雪松松針粗多糖對·OH和DPPH·自由基有較好的清除能力，且呈現出良好的量效關系，對前者的清除率在1.4 g/L達100%，對后者的清除率在0.4 g/L時可以達到90%，粗多糖對·OH和DPPH·的半抑制濃度IC50分別為0.47 g/L和0.076 g/L。純化多糖對兩種自由基的清除率在1.4 g/L時僅為26.50%和27.71%，粗多糖對·OH和DPPH·的清除能力遠高于純化多糖，分析原因可能是粗多糖中的半乳糖醛酸質量濃度高于純化多糖，松針多糖的抗氧化能力可能主要取決于其中的半乳糖醛酸含量或者是多糖半乳糖醛酸復合物協同作用的結果。與傳統的水提法相比，超聲波酶法提取松針多糖工藝具有較高的提取效率，雪松松針粗多糖表現出較強的體外抗氧化能力。并且采用高效液相色譜、紅外光譜和核磁共振等對松針多糖結構進行了初步表征，為松針多糖結構的進一步研究和多糖的高值化利用提供依據。