香水蓮花提取物對東莨菪堿誘導記憶障礙小鼠學習記憶能力的影響

王 微，葉虔臻，項 婷，吳曉琴，沈建福

浙江大學生物系統工程與食品科學學院，杭州 310058

阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease ,AD)是一種常見的神經退行性疾病，其臨床主要表現為記憶力減退和認知功能障礙。研究表明，影響AD患者的認知障礙的發病機制十分復雜，存在多種假說，如膽堿能損傷假說、氧化應激假說、Aβ毒性假說、Tau 蛋白假說等[1]。另外，AD患者的短期和長期記憶還受到神經元分子水平上的調節。腦源性神經營養因子(brain derived neurophic factor,BDNF)影響神經元的存活、分化和生長，并且介導突觸可塑性和認知過程，其水平的變化與認知障礙密切相關[2]，而ERK/CREB/BDNF信號通路的激活可能是開發具有記憶增強特性的新化合物有希望的靶點[3]。就目前而言，臨床治療AD的首選藥物還主要是針對膽堿能損傷假說研發的乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AChE)抑制劑，包括多奈哌齊、加蘭他敏、卡拉巴汀和石杉堿甲(Huperzine A,Hup.A)等。但是，這些藥物只能減輕癥狀，并不能延緩或阻止AD的病程，還具有一定的副作用。因此，研究者正積極尋找一種天然、安全、有效的預防和治療手段。

香水蓮花(Nymphaeahybrid)是睡蓮科睡蓮屬熱帶大型睡蓮，集觀賞和食用價值于一身，其食用安全性已經得到證實[4]。研究證實，香水蓮花富含多酚類化合物，具有較強的抗氧化能力，且整花優于花瓣，藍色花和紫色花優于黃色花[5]。香水蓮花中已鑒定出有柚皮素、柯里拉京、蠟菊素A等化合物[6,7]。其中，柚皮素和柯里拉京在神經保護方面具有一定的作用[8,9]。目前，國內外對香水蓮花生物學活性的研究較少，而香水蓮花對學習記憶能力的影響更是未見報道。基于此，本研究采用腹腔注射東莨菪堿(scopolamine,SCO)建立記憶障礙的AD小鼠模型，研究香水蓮花提取物對小鼠學習記憶能力的影響，并對其作用機制進行探究，以期為進一步研究香水蓮花的食用價值，開發功能性食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍色香水蓮花(干花)由杭州蕓麒龍祥生物技術有限公司提供；東莨菪堿(批號S107418)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；石杉堿甲，上海復旦復華藥業有限公司；總超氧化物歧化酶、丙二醛、谷胱甘肽過氧化物酶、乙酰膽堿酯酶、乙酰膽堿、BCA蛋白濃度等測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；BDNF抗體(ab108319)、CREB抗體(ab32515)、p-CREB(ab32096)抗體均購自Abcam公司；p-ERK1/2(#9106)、ERK1/2(#4696)抗體購自Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG二抗購自Thermo Pierce公司；其他試劑均為分析純或化學純。

1.2 實驗動物

清潔級健康ICR雄性小鼠40只(體重30～35 g)，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供，合格證號IACUC-20180319-05。飼養條件：自由飲水、進食標準小鼠飼料；室內適度通風，光照12 h，室溫25 ℃，濕度(60±10)%。

1.3 儀器與設備

酶標儀，美國BioTek公司；低溫高速離心機，德國Eppendorf公司；Mini-PROTEAN電泳系統以及MiniTrans-Blot轉印系統，美國Bio-Rad公司；水平脫色搖床，國產華利達；Morris水迷宮裝置，北京碩林苑科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 香水蓮花提取物制備

香水蓮花提取物(Nymphaeahybridextract,NHE)制備參照董柳青的方法[7]：藍色香水蓮花干花粉碎，過60目篩，稱取香水蓮花粉末200 g，按1∶10料液比(W/V)加入60%乙醇，50 ℃超聲浸提1 h后，離心分離，上清液減壓濃縮除去有機溶劑，真空冷凍干燥后得到香水蓮花提取物，得率為34.68%。NHE經Folin-Ciocalteu法測得總酚含量為309.73±4.42 mg GAE/g，酚類化合物含量較高。

1.4.2 動物分組、給藥及造模

ICR小鼠適應性喂養一周后，隨機分為5組，每組8只：正常組、模型組、NHE低劑量組、NHE高劑量組、陽性對照組。NHE的低、高劑量組和陽性對照組分別灌胃給藥200 mg/kg、400 mg/kg的NHE和0.2 mg/kg的陽性對照藥石杉堿甲，正常組和模型組則以等量蒸餾水灌胃。每天上午8點給藥，連續給藥22天，并且每天一次，灌胃體積為0.02 mL/g。

在第17～22天進行Morris水迷宮行為學實驗，測試時間在每天上午10點至下午4點之間。測試前30 min，模型組、陽性對照組、NHE低、高劑量組均腹腔注射東莨菪堿(3 mg/kg)，建立小鼠學習記憶障礙模型。正常組則注射等量生理鹽水。腹腔注射體積為0.01 mL/g。

1.4.3 Morris水迷宮實驗

根據文獻[10]，采用Morris水迷宮實驗測定小鼠空間學習和記憶能力。實驗在給藥的第17天進行，歷時6天，分為定位航行實驗和空間搜索實驗兩部分。(1)定位航行實驗：實驗開始前，讓小鼠自由游泳2 min以適應周圍環境。正式實驗時，每天訓練4次，每次從不同的入水點將小鼠面向池壁放入水池，儀器自動記錄從入水到找到水下隱蔽平臺并立于其上所需時間即逃避潛伏期。如果小鼠在60 s內未找到平臺，由實驗者將其引至平臺上停留10 s，逃避潛伏期記為60 s。記錄每天各組4次尋找平臺的潛伏期，以4次的平均值作為當天尋找平臺的潛伏期，此項用于檢測動物的學習能力。(2)空間搜索實驗：第6天撤除平臺進行空間搜索實驗，用于測量記憶保持能力。任選一個入水點將小鼠放入水中，記錄60 s內小鼠的游泳軌跡并進行分析。計算小鼠停留在目標象限停留時間的百分比及穿越原平臺的次數。

1.4.4 生化指標測定

行為學實驗結束后，每組取4只，斷頭處死小鼠，迅速取出腦組織(分離海馬和皮質)，稱重，用冰冷的生理鹽水洗凈，然后加入9倍體積的冰冷生理鹽水制成10%的腦組織勻漿，用低溫離心機3 500 rpm離心10 min，取上清液，按照試劑盒的方法測定其中的SOD、MDA、GSH-PX等氧化應激相關指標，測定AChE活性及ACh含量等膽堿能系統相關指標[11]。

1.4.5 Western blot檢測海馬和皮質ERK-CREB-BDNF信號通路相關蛋白的表達

行為學實驗結束后，每組取4只，斷頭處死小鼠，迅速取出腦組織，冰上分離海馬和皮質，液氮保存。海馬和皮質加適量RIPA裂解液冰上裂解15 min，12 000 rpm離心15 min，取上清，利用BCA 法測定總蛋白濃度。用10% SDS-PAGE分離蛋白樣品，并轉移到PVDF 膜上。用含5%脫脂奶粉的TTBS封閉膜1 h，加入一抗(BDNF(稀釋1∶1 500)，CREB(稀釋1∶800)， p-CREB(稀釋1∶5 000)，ERK(稀釋1∶2 000)， p-ERK(稀釋1∶2 000)，β-actin(稀釋1∶1 500)，4 ℃，過夜。次日，以TTBS洗膜3次，再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h后TTBS洗膜，化學發光法檢測蛋白條帶，用BandScan 5.0軟件進行分析。

1.4.6 數據處理與統計

實驗結果均采用SPSS 20.0軟件進行分析，數據均以表示。采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 Morris水迷宮實驗結果

2.1.1 定位航行結果

各組小鼠找到平臺的逃避潛伏期如圖1 所示，隨著訓練天數的增加，各組小鼠的逃避潛伏期均呈減少的趨勢。訓練第1天，各組小鼠的逃避潛伏期無顯著性差異。第2～5天，與正常組相比，模型組小鼠的逃避潛伏期明顯延長(P<0.01)，這說明東莨菪堿致記憶障礙模型成功建立；與模型組相比，NHE低、高劑量組的小鼠逃避潛伏期極顯著縮短(P<0.01)，尤其是高劑量組；同樣地，陽性對照組小鼠的逃避潛伏期在第2天時顯著小于模型組(P<0.05)，第3～5天的訓練中極顯著小于模型組(P<0.01)。

圖1 定位航行實驗中各組小鼠的逃避潛伏期(n=8)Fig.1 Escape latency of each group of mice in the navigational experiment (n=8)注：*P<0.05，**P<0.01，與正常組比較；#P<0.05，##P<0.01，與模型組比較。Note:compared with the normal group,*P<0.05,**P <0.01;compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

2.1.2 空間探索結果

第6天撤去平臺，讓小鼠進行60 s的空間探索。如圖2A和2B所示，與正常組相比，模型組小鼠的穿越平臺次數和在目標象限停留時間百分比明顯減少(P<0.01)；與模型組相比，NHE低、高劑量組和陽性對照組穿越平臺的次數和目標象限停留的時間百分比明顯增多(P<0.05或P<0.01)。而Morris水迷宮實驗軌跡類型主要分為4 種：趨向型、直線型、隨機型、邊緣型[12]。小鼠的游泳軌跡如圖2C所示，正常組以趨向型和直線型為主，表現為有目的的搜索；模型組以邊緣型為主，表現為無目的的搜索；NHE低、高劑量組和陽性對照組改善了小鼠的游泳模式，尤其是高劑量組，趨向型軌跡增多。

2.2 NHE對小鼠腦組織SOD、GSH-PX活力及MDA含量的影響

由表1可知，與正常組相比，模型組小鼠海馬和皮質的SOD、GSH-PX活力均極顯著降低(P<0.01)，MDA含量極顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，NHE低劑量組小鼠的海馬和皮質的MDA含量極顯著(P<0.01)減少，而SOD和GSH-PX活力的影響則無顯著性差異；與模型組相比，NHE高劑量組小鼠的海馬和皮質中SOD和GSH-PX活力顯著升高(P<0.01,P<0.05)，MDA含量極顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，陽性對照組的小鼠皮質中SOD活力顯著升高(P<0.05)，GSH-PX活力極顯著升高(P<0.01)，海馬中SOD和GSH-PX的活力有所提高但無顯著性差異(P>0.05)，而海馬和皮質中的MDA含量均極顯著減少(P<0.01)。

圖2 空間探索實驗中各組小鼠的記憶保持能力(n=8)Fig.2 Memory retention ability of each group of mice in the space exploration experiment (n=8)注：*P<0.05，**P<0.01，與正常組比較；#P<0.05，##P<0.01，與模型組比較。Note:compared with the normal group,*P<0.05,**P <0.01;compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

表1 NHE對小鼠腦組織SOD、GSH-PX活力及MDA含量的影響(n=4)

注：*P<0.05，**P<0.01，與正常組比較；#P<0.05，##P<0.01，與模型組比較。

Note:Compared with the normal group,*P<0.05,**P<0.01;compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

2.3 NHE對小鼠腦組織ACh和AChE的影響

如圖3A和3B所示，與正常組相比，模型組小鼠海馬和皮質的ACh含量極顯著減少(P<0.01)，AChE活性極顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，NHE低、高劑量組小鼠的海馬和皮質ACh含量均極顯著增加，AChE活性極顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，陽性對照組小鼠的海馬和皮質的ACh含量明顯增加(P<0.01,P<0.05)，AChE活性極顯著降低(P<0.01)。

2.4 NHE對小鼠腦組織ERK-CREB-BDNF信號通路的影響

為了進一步闡明NHE保護東莨菪堿誘導的記憶障礙的作用機制，本研究探究了NHE對BDNF、p-ERK和p-CREB表達的影響(圖4)。如圖5C所示，東莨菪堿明顯降低了大腦海馬和皮層中的BNDF蛋白的表達水平(P<0.01)。同時，低劑量的NHE(200 mg/kg)和石杉堿甲(0.2 mg/kg)可以預防東莨菪堿誘導的BDNF蛋白表達水平的降低(P<0.01)。此外，如圖5A和5B所示，對ERK和CREB的磷酸化水平進行測定發現，低劑量的NHE(200 mg/kg)和石杉堿甲恢復了大腦海馬和皮層中東莨菪堿引起的ERK和CREB磷酸化減少。

圖3 NHE對小鼠腦組織ACh和AChE的影響(n=4)Fig.3 Effect of NHE on ACh and AChE in mouse brain tissue (n=4)注：*P<0.05，**P<0.01，與正常組比較；#P<0.05，##P<0.01，與模型組比較。Note:Compared with the normal group,*P<0.05,**P <0.01;compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

圖4 免疫印跡實驗檢測小鼠腦組織ERK-CREB-BDNF信號通路的蛋白表達Fig.4 The protein expression of ERK-CREB-BDNF signaling pathway in mouse brain tissue by Western blot

3 討論

研究證實AD的病理學特征主要為：受影響的腦區產生廣泛的氧化應激、膽堿功能障礙、淀粉樣斑塊、神經元纖維纏結以及神經元的丟失等，尤其是在與學習和記憶密切相關的海馬和前額葉皮質[13]，但是具體發病機制至今尚未十分清楚。為了尋求有效的防治手段，研究者從影響AD認知缺陷的不同機制出發，開發了各種體內外實驗模型。其中，東莨菪堿誘導的記憶障礙動物模型，因其簡單、經濟、方便等優點，常用于防治AD活性化合物的初步篩選[14]。東莨菪堿是一種毒蕈堿受體拮抗劑，可以透過血腦屏障阻斷中樞乙酰膽堿與其受體的結合，造成膽堿能神經信號傳遞障礙，從而干擾動物和人類的記憶，特別是學習獲得和短期記憶的過程。研究證實，東莨菪堿能夠影響動物的行為學、大腦的氧化應激狀態和神經化學變化等多方面[15]。本研究采用腹腔注射東莨菪堿造模，通過Morris水迷宮實驗檢測小鼠的學習記憶能力。結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺次數和目標象限停留時間百分比顯著減少，游泳軌跡以邊緣型為主，說明記憶力障礙模型造模成功；與模型組比較，低劑量(200 mg/kg)的NHE即可逆轉東莨菪堿對小鼠造成的記憶缺陷，具體表現在逃避潛伏期顯著縮短，穿越平臺次數和目標象限停留時間百分比顯著增加，改善了小鼠的游泳模式。

廣泛的氧化應激是AD患者腦內的主要特征[16]。大腦主要由脂質組成，且具有較高的耗氧率，使得其容易受到活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的攻擊[17]。MDA是機體內的一種重要的脂質過氧化物產物，其含量的高低反映機體的氧化應激水平。而SOD和GSH-Px等超氧化物酶能夠有效清除體內的ROS，其活性的高低能反映機體清除自由基的能力。MDA水平和SOD、GSH-Px活性可以綜合評價體內的氧化應激水平。本研究結果表明，與模型組比較，NHE的干預，提高了小鼠海馬和皮質的SOD、GSH-PX活性，降低了MDA含量，這提示NHE可能通過緩解腦內的氧化應激來改善東莨菪堿引起的記憶力障礙。

圖5 NHE對小鼠腦組織ERK-CREB-BDNF信號通路的影響(n=4)Fig.5 Effect of NHE on ERK-CREB-BDNF signaling pathway in mouse brain tissue (n=4)注：(A)p-ERK蛋白的相對表達量；(B)p-CREB蛋白的相對表達量；(C)BDNF蛋白相對表達量；*P<0.05，**P<0.01，與正常組比較；#P<0.05，##P<0.01，與模型組比較。Note:(A) relative expression of p-ERK protein;(B) relative expression of p-CREB protein;(C) relative expression of BDNF protein;compared with the normal group,*P<0.05,**P <0.01;compared with the model group, #P<0.05,##P<0.01.

膽堿能系統的異常與記憶障礙有關。AD患者腦內乙酰膽堿(Acetylcholine,ACh)的減少被認為是認知和記憶功能損傷的直接原因。ACh是人腦內的一種重要的神經遞質，能調節認知功能和學習記憶過程。ACh能被AChE迅速分解，通過抑制AChE可以增加突觸間隙中的ACh，從而改善認知功能。乙酰膽堿酯酶抑制劑依然是現階段最有效的治療手段。本研究結果表明，與模型組比較，NHE可以使東莨菪堿誘導的記憶障礙模型小鼠海馬和皮層中ACh 含量增多，AChE 活性降低。這提示，NHE可能通過抑制AChE 的活性，減少ACh水解，維持膽堿能系統的功能。

ERK-CREB-BDNF信號通路的激活與提高學習記憶能力有關[3]。AD患者腦內和血清中BDNF的含量減少，并且不同病程階段有所差別，與癡呆的嚴重程度相關[18]，可以作為AD的診斷指標之一。研究表明，天然產物則可以通過間接調節BDNF水平起到改善認知的作用，如藍莓提取物[19]，文冠果提取物[20]等。環磷腺苷反應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)是一種轉錄因子，在BDNF轉錄調節中發揮重要作用，但是磷酸化的CREB 才能激活下游基因的表達，而CREB的激活依賴于細胞外信號調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)通路[21]。因此，ERK-CREB-BDNF信號通路的激活可以改善認知障礙。本研究結果顯示，東莨菪堿造成小鼠海馬和皮質中BDNF含量減少，ERK和CREB的磷酸化減少。而NHE(200 mg/kg)的干預減輕了東莨菪堿的損傷，使得ERK和CREB的磷酸化增加，BDNF的表達增多。這些結果表明，NHE的記憶增強作用可能是由大腦海馬和皮質中ERK-CREB-BDNF信號通路的激活所介導的。

綜上所述，NHE可以提高東莨菪堿誘導的記憶障礙小鼠的學習記憶能力，且200 mg/kg的劑量就能起相應的作用，具體機制可能涉及緩解大腦的氧化應激損傷，平衡膽堿能系統，激活ERK-CREB-BDNF信號通路。但是，NHE只是一個粗提物組分，含有309.73±4.42 mg GAE/g的酚類化合物，其他的成分可能是多糖、生物堿、皂苷[7]等，而發揮關鍵作用的化合物還需進一步研究。