面包樹果實凝集素的提取純化及理化性質分析

張曉青，施 青，楊愈豐*

1遵義醫科大學珠海校區;2珠海市中藥基礎與應用研究重點實驗室，珠海 519040

凝集素是一類能通過特異地結合碳水化合物而可逆地識別或附著于細胞表面的非酶蛋白質[1]，廣泛存在于動物、植物和微生物等多個物種。植物凝集素主要分布在植物的儲藏器官和繁殖器官[2]，可用于檢測機體癌變過程中細胞表面糖基的變化[3,4]，從而協助腫瘤的診斷和治療[5]。另外，植物凝集素還可以用于阻礙病毒的再次感染[6,7]，或者作為抗生素的有效輔助劑[8]。目前，凝集素已經是細胞生物學、免疫學乃至臨床醫學的重要檢測或診斷工具。

FTL是一種能夠特異性結合α-D-半乳糖的糖蛋白[9]，主要來源于面包樹果實籽，可以通過分離純化獲得[10]。FTL是一個四聚體分子，每個單體包含一個α鏈和一個β鏈，主要由β折疊構成形成四個糖結合位點，屬于Jacalin家族[11,12]，分子量大小為17.1 KD。研究表明，FTL可以用于腫瘤標志物的檢測，如前列腺癌的診斷等[11]。另外，FTL還具有誘導宮頸癌細胞凋亡和抑制癌細胞增殖等作用[13]，提示其可能存在潛在的抗癌作用。

關于FTL的分離純化，國外已有相關報道，主要通過浸提、沉淀和親和層析得到純品[10]。但該方法并沒有詳細的優化，且生產周期較長，成本較高，并不是特別適合工業化生產。另一方面，學術界對包括FTL在內的多種凝集素均有重組表達的嘗試，盡管已有多種優化方案，但產量均極低(約20 mg/L)，顯然難以滿足工業化的要求[14]。在重組表達產量未有質的突破，而FTL應用前景又十分廣闊的當下，重新優化提取純化的方案仍然很有必要。因此，本論文根據FTL自身的特點，采用在較高溫度條件下浸提和硫酸銨沉淀的方法快速得到FTL粗提物，并通過陽離子交換層析進一步純化得到FTL純品。本論文通過對各個提取條件的優化，建立了一個優化的FTL分離純化方案。該方案能明顯縮短FTL的提取時間，提高FTL分離純化效率，總體上降低FTL的生產成本。最后本論文還對所提FTL的部分理化性質進行了研究，為后續對FTL的深入研究奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

面包樹果實采摘自珠海市三灶鎮金灣區安和生化科技有限公司珠海安和園；健康小鼠購自廣東省醫學實驗動物中心；V型96孔板購自廣州市浩特偉生物制品有限公司；XK1620層析柱和陽離子交換層析填料均為GE產品；BCA蛋白定量試劑盒購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；其它試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Multifuge XIR型臺式高速冷凍離心機：美國Thermo Scientific公司；勻漿機：廣東小熊電器有限公司；恒溫水浴鍋：汕頭市醫用設備有限公司；pH計：上海儀電科學儀器有限公司；AKTA純化儀：通用電氣醫療；電泳儀：北京君意東方電泳設備有限公司;Multiskon Go 酶標儀：美國 Thermo Scientific。

1.3 實驗方法

1.3.1 FTL粗品的制備

稱取新鮮的面包樹果實籽50 g，加入100 mL的Tris-HCl緩沖液(含0.02 mol/L Tris，0.2 mol/L NaCl，pH=7.2)，經勻漿機打勻成漿，于50 ℃的條件下浸提2 h，用4層紗布過濾。濾液于4 ℃、5 000 rpm條件下離心20 min，取上清液。在上清液中加入固體硫酸銨至飽和度為20%，靜置2 h，4 ℃、5 000 rpm條件下離心20 min，取上清液。上清液中繼續加入固體硫酸銨至飽和度為80%，靜置2 h，4 ℃、5 000 rpm條件下離心20 min，棄上清液，沉淀用4 mL Tris-HCl緩沖液(0.02 mol/L Tris，0.2 mol/L NaCl，pH=7.2)重懸，得FTL粗品。

1.3.2 凝血試驗

1.3.2.1 2%小鼠紅細胞懸液的制備:參照文獻[15]，用濃度為5%的水合氯醛對小鼠進行麻醉，眼眶采血約2 mL，置于含有50 μL肝素鈉的10 mL離心管中，經4 ℃、2 000 rpm，離心10 min，棄上清液，再加入5 mL左右的TBS緩沖液(含0.02 mol/L Tris-HCl，0.15 mol/L NaCl，pH=7.4)，輕搖混勻，4 ℃、1 500 rpm離心5 min，棄上清液，如此重復3～4次，直至上清液無色為止。最后按紅細胞擠壓體積加入相應量的TBS-Ca2+溶液(含0.02 mol/L Tris-HCl，0.15 mol/L NaCl，0.1 mol/L CaCl2，pH=7.4)配置成2%的紅細胞懸液。

1.3.2.2 紅細胞凝集試驗：FTL的紅細胞凝集試驗采用血凝法[16]，首先在V型96孔板的每一孔中加入25 μL的TBS-Ca2+溶液，然后在各行的首孔中加入25 μL 的FTL，混勻后，從首孔中吸出25 μL 于第二孔中，再混勻后，吸出25 μL于第三孔中，依此類推做倍比稀釋，到最后一孔時，混勻后，吸去25 μL。最后，每孔加入25 μL的2%小鼠紅細胞懸液輕吹混勻。室溫放置60 min后，觀察凝集現象。無凝集反應時，紅細胞在V型96孔板底部沉積為一光滑的小圓點；發生凝集反應時，紅細胞聚集成絮狀物。當出現凝集現象時的最大稀釋倍數的倒數定義為一個活力單位[10]，用稀釋倍數(2n)表示凝集效價[17]。

1.3.3 FTL粗品提取條件的優化

按照1.3.1中的步驟，對FTL粗品依次進行硫酸銨飽和度、浸提液體積、硫酸銨沉淀時間、浸提時間和浸提溫度優化。以上每個優化試驗均重復4次，取凝集效價值最小的試驗結果作為最終結果。

1.3.4 FTL粗品的純化

取30 mL的FTL粗品于截留分子量為7 KD的透析袋中，4 ℃條件下透析24 h。透析后的FTL樣品用20倍體積的層析緩沖液I(20 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4，pH6.5)稀釋，4 ℃、13 000 rpm離心30 min，取上清液上平衡好的陽離子交換層析柱，流速為5 mL/min，上樣結束后用層析緩沖液I沖洗至基線平衡。最后使用層析緩沖液II(20 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4，500 mmol/L NaCl，pH6.5)進行連續梯度洗脫，洗脫時間為30 min，流速10 mL/min，收集每個洗脫峰，并將收集的洗脫峰分別進行凝血試驗?；钚越M分用截留分子量為10 KD的超濾濃縮管濃縮備用。

1.3.5 FTL純品的純度檢測

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法進行FTL的純度檢測[18]，分離膠濃度為15%，濃縮膠濃度為5%。

1.3.6 FTL純品的蛋白定量

蛋白質含量的測定采用BCA法[19]，以牛血清白蛋白濃度為標準，在562 nm波長處測定蛋白質含量。

1.3.7 FTL純品的理化性質研究

1.3.7.1 糖抑制試驗：參照文獻[15]，分別配制濃度為0.2 mol/L的D-甘露糖、半乳糖、木糖、D-果糖、蔗糖、D-葡萄糖和麥芽糖溶液，然后將FTL純品和各種糖溶液按照1∶1的比例混合后，靜置1 h。首先在V型96孔板各孔中加入25 μL的TBS-Ca2+溶液，然后在各行的首孔中分別加入用各種糖處理后的FTL純品并做倍比稀釋，最后一孔吸去25 μL。每孔加入25 μL 2%的小鼠紅細胞懸液，輕吹混勻。以TBS-Ca2+溶液作對照。室溫靜置30 min后觀察并記錄實驗結果。

1.3.7.2 熱穩定性試驗：參照文獻[15]，取FTL純品于5個EP管中，每管50 μL，標記后分別置于50-90 ℃條件下水浴3 h。對不同溫度處理的FTL純品做凝血試驗，觀察并記錄實驗結果。

1.3.7.3 pH穩定性試驗：參照文獻[15]，配制不同的緩沖體系： 0.1 mol/L 的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH：2.6～5.6)；0.1 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH6.6)； 0.1 mol/L 的Tris-HCl緩沖液(pH7.6)；0.1 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH：8.6～10.6)。按照上述糖抑制試驗方法，將不同的糖溶液換成不同的pH值緩沖液做凝血試驗，觀察并記錄試驗結果。

1.3.7.4 金屬離子穩定性試驗：參照文獻[15]，分別配制濃度為0.2 mol/L的K+、Ca2+、Fe3+、Mg2+、Ni+、Mn2+、Ba2+、Zn2+、Al3+溶液。按照上述糖抑制試驗方法，將不同的糖溶液換成不同的金屬離子緩沖液做凝血試驗，觀察并記錄試驗結果。以上每個試驗均重復4次，取凝集效價值最小的試驗結果作為最終結果。

2 結果與分析

2.1 FTL粗提條件的優化

當硫酸銨飽和度為60%時，第6孔底部開始產生沉淀(形成小圓點)，當硫酸銨飽和度為70%～100%時，都是第7孔底部開始產生沉淀，由此可見硫酸銨飽和度70%以后FTL沉淀已經充分，無法再通過提高硫酸銨飽和度來提高產率，確定第二次硫酸銨飽和度為70%(圖1)。

圖1 第二次硫酸銨沉淀Fig.1 The second ammonium Sulfate saturation注：為簡化描述，所有凝血試驗結果經記錄后整理成表1。Note:For describe the result tersely,all haemagglutinating activity result was counted and tabulated as table 1.

基于傳統的沉淀模式，我們在確定第二次硫酸銨沉淀的飽和度后，希望通過確定第一次硫酸銨沉淀的飽和度去掉部分雜蛋白。結果顯示當硫酸銨飽和度達到10%時，便有FTL沉淀出，沉淀物的SDS-PAGE電泳結果顯示有明確的FTL條帶，且雜蛋白量很少(數據沒有提供)，提示該步驟能去除的雜蛋白量并不多。因此，為了兼顧回收率和提取效率，最終確定不進行兩步硫酸銨沉淀，而是直接用70%的硫酸銨一步沉淀得到FTL粗品。料液比試驗結果顯示比例為1∶2時提取效率最佳。當硫酸銨沉淀時間達到4 h時，FTL已沉淀充分。當浸提時間為2 h時， FTL已得到充分浸提。隨著浸提溫度升高，所得FTL的凝集效價先高后低。當浸提溫度為50～60 ℃時，FTL的凝集效價最大。因此，最終的浸提溫度確定為50 ℃。浸提溫度的升高在一定的范圍內可以有效地縮短浸提時間，提高浸提效率。同時還可能導致部分熱穩定性差的雜蛋白變性析出，簡化后續的分離純化過程。

表1 FTL的提取優化

注：硫酸銨飽和度優化每間隔10%設置一個梯度，第二個硫酸銨飽和度優化范圍為60%～100%，第一個硫酸銨飽和度優化范圍為10%～50%；浸提液體積優化的料液比梯度范圍是1∶1～1∶5(g/mL)；硫酸銨沉淀時間優化的梯度范圍是2～8 h，每間隔2個小時設置一個梯度；浸提時間優化的梯度范圍是1～4 h，每間隔1個小時設置一個梯度；浸提溫度優化的梯度范圍是40～80 ℃，每間隔10 ℃設置一個梯度。

Note：The second ammonium sulfate saturation ranges from 60% to 100%,while the first one ranges from 10% to 50%,of which the concentration gradient of 10% was set.The ratio of material to liquid ranges from 1∶1 to 1∶5 (g/mL).The precipitation time of ammonium sulfate ranges from 2 to 8 h with two hours of interval.The extraction time ranges from 1 to 4 h with one hour of interval.The extraction temperature ranges from 40 ℃ to 80 ℃ with 10 ℃ of interval.

2.2 FTL的陽離子交換層析

FTL在所設條件下與陽離子交換層析填料結合力不是很強，當NaCl濃度為0.15 mol/L時，有一個很明顯的洗脫峰，洗脫峰組分經SDS-PAGE和凝血試驗檢測確定為目的蛋白，洗脫液做超濾濃縮得FTL純品。

圖2 FTL粗品的陽離子交換層析Fig.2 Cation exchange chromatography of crude FTL

2.3 FTL純品的SDS-PAGE電泳

FTL有兩個條帶，分子量分別約為15.5、12.0 kD(圖2)，可能為糖基化程度不同的兩條α鏈，大小與相關文獻報道一致[10,14]。另外在27 KD和20 KD附近有三微弱的條帶，可能是樣品濃度過高產生的二聚體，總體上看FTL的純度比較高。

2.4 FTL純品的蛋白定量

2.4.1 蛋白濃度標準曲線圖

根據蛋白質含量標準曲線測得FTL純品的濃度為117.5 mg/mL。

圖3 FTL的SDS-PAGE電泳Fig.3 SDS-PAGE of FTL注：泳道1：FTL純品；泳道2：蛋白Marker。Note:Lane 1,purified FTL;Lane 2,protein Marker.

圖4 蛋白濃度標準曲線Fig.4 Standard curve of protein concentration

2.4.2 FTL分離純化過程分析

FTL粗品的總蛋白量為843.3 mg，比活力為4 128.5 U/mg，是Tris-HCl浸提液的比活力的1.5倍，蛋白回收率為46%。經過陽離子交換層析后，FTL純品的比活力達到6 201.3 U·mg-1，純化倍數為2.2，蛋白回收率達到22%(表2)。

表2 FTL分離純化過程

2.5 FTL純品的理化性質研究

試驗中所用的糖對FTL的凝血活性幾乎無影響，提示FTL不會被試驗中所用的糖所抑制；當溫度為50 ℃時，FTL的凝集效價最大，隨著溫度的升高，FTL的凝集效價逐漸降低，表明FTL是一種熱穩定性較好的凝集素。60 ℃以下時，其凝集效價保持穩定。金屬離子穩定性試驗結果顯示FTL對試驗中所用的金屬離子均不敏感，說明FTL并不依賴于金屬離子來發揮其凝血活性。FTL在pH值為2.6到10.6的環境下處理1 h，其凝集效價依然與未處理時相同，表明FTL對酸堿的耐受性較高，對化學變性劑有較強的抵抗力(表3)。

表3 FTL純品的理化性質研究

注：CK為空白對照。

Note:CK is short for blank control.

3 結論

本論文利用FTL的熱穩定性等特點建立了一個較高溫度條件下較短時間浸提的提取和純化工藝?？傮w而言，所建立FTL分離純化方案較為簡單，耗時短，總體成本較低，回收率較高，有較好的應用價值。