深山含笑葉過氧化物酶對雙酚A清除效應研究

趙廣華，肖 強*，洪 健

1湖北民族學院 生物資源保護與利用湖北省重點實驗室；2湖北民族學院林學園藝學院，恩施 445000

深山含笑(MicheliamaudiaeDunn)，又名光葉白蘭、莫夫人玉蘭，木蘭科含笑屬，常綠喬木。中國特有物種，主要分布在浙江、福建、湖南、廣東、廣西、貴州等地。具有生長快、材質好，葉片冬季不凋，早春花色純白艷麗、味清香等特性。其樹型美觀，是較好的園林觀賞樹種；我們在研究木蘭科植物酶譜多樣性時，發現深山含笑葉片具有較高過氧化物酶活性。

過氧化物酶(Peroxidase，POD，EC 1.11.1.7)是一種以過氧化氫為電子受體，通過催化底物發生氧化反應改變結構，引起底物理化性質發生變化的生物催劑。它廣泛分布于動植物和微生物體內，在細胞中發揮清除過氧化氫作用[1]。POD在植物細胞壁形成、生長激素失活、次生物質代謝以及防衛反應應答等多種生理過程中發揮重要作用[1]。POD催化活性在工業上也用于石化、造紙、紡織等行業廢水中酚類和芳香胺類污染物高效降解[2]。國內外許多學者開展了對辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)、大豆過氧化物酶(Soybean peroxidase，SBP)和刺桐葉過氧化物酶等用于酚類物質清除的條件優化、動力學特性和反應機理研究[3-5]，展現了POD在去除環境水體中微量酚類污染物中的良好前景。

雙酚A(Bisphenol A，BPA)是一種重要的有機化工原料，廣泛應用于聚碳酸酯、環氧樹脂、阻燃劑、增塑劑、橡膠抗老化劑等生產中，用這些材料生產的終端產品，如嬰兒奶瓶，微波爐飯盒、食品包裝盒、飲料罐等均含有BPA。BPA的廣泛應用帶來了日漸嚴重的環境污染：在日本垃圾處理場和堆肥水樣中均可檢出BPA，其平均濃度達269 μg/L[6]。BPA等酚類化合物是內分泌干擾物(Endocrine disrupting Chemicals，EDCs)的重要成員之一，20世紀80年代以來的系列研究表明，BPA對水生生物和人體細胞具有雌激素作用和生物學毒性[7,8]；能干擾人體內正常激素的分泌，從而影響生殖功能，增加腫瘤的發病率；即使是低劑量染毒，也能造成嚴重的損傷。EDCs具有生物富集、效用持久以及生理學響應濃度極低等特性，使得其在水體中很難通過傳統水處理技術去除。目前對環境中BPA的消除主要采用生物降解、光催化的化學降解、物理吸附以及生物酶降解等方法；其中，基于POD的降解方法具有高效、反應條件溫和等優點受到廣泛關注。

為了探討深山含笑葉片POD在清除水體中EDCs中應用前景，開發其葉片經濟價值，我們對深山含笑葉片POD進行了快速分離純化；在此基礎上進一步考察了其對水體中EDCs類物質BPA的去除效果及反應條件。該研究對于降低使用POD處理廢水的運營成本，探索新的具有較強清除能力的POD，通過優化反應條件，有效去除EDCs類污染物具有重要價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以湖北民族學院植物園內種植的10年齡深山含笑(MicheliamaudiaeDunn)(經湖北民族學院林學園藝學院易詠梅教授鑒定)成熟葉為原料。

1.2 試驗方法

1.2.1 粗酶液制備

稱取成熟深山含笑樹葉500 g，加入10 g PVPP，在液氮中迅速研磨，然后加入2 000 mL含10%聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30)和2 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸緩沖液(50 mmol/L，pH7.8)，室溫下連續攪拌22～24 h。4層紗布過濾，經測定濾液所得可溶態POD(Soluble Peroxidase，SPOD)的活性較低(見圖1)，丟棄，留下含水濾渣約180 g；按照ukalovic等[9]的方法，即采用1%(w/v)吐溫80，1 mol/L NaCl提取濾渣中的結合態POD(Bound Peroxidase，BPOD)。室溫下攪拌提取2～5 h，在4 ℃ 12 000 g條件下，離心20 min，得到大約800 mL粗酶液，置于4 ℃冰箱冷藏待用。

圖1 可溶性POD與結合態POD比活力比較Fig.1 Comparison of specific activity between soluble POD and bound POD注：不同字母表示在P<0.05水平上差異顯著。Note：Values followed by a different letter are significantly different at the 0.05 probability level.

1.2.2 雙水相萃取(Aqueous two-phase extraction，ATPE)

上述約800 mL粗酶提取液在攪動中緩慢加入80 g硫酸銨粉末，充分溶解后，再緩慢加入112 g聚乙二醇4000(PEG 4000)，并在振蕩器上振蕩，使其形成14% PEG 4000(W/V)-10% (NH4)2SO4(W/V)的雙水相體系，轉移至分液漏斗中靜置萃取2 h或者將雙水相體系轉入離心管中，5 000 g離心5 min左右，其萃取除色效果如圖2所示。然后取下相(鹽相)，轉移至透析袋中，蒸餾水透析除鹽；每8 h更換一次水，直至透析液用1% BaCl2檢測無沉淀產生為止(一般在有磁力攪拌器攪拌的情況下，更換3次水蒸餾水即可達到除鹽效果)。

圖2 14%(w/v)PEG 4000-10%(w/v)硫酸銨雙水相萃取效果圖Fig.2 Photograph showing the effect of ATPE with phase composition 14%(w/v)PEG 4000/10% ammonium sulfate (w/v) 注：a:粗酶液，b:雙水相萃取體系Note:a:Crude extract,b:System with Aqueous two-phase extraction

1.2.3 蛋白質層析

根據pH梯度預實驗可知，目標酶蛋白在離子濃度小于50 mmol/L、pH大于9.5(Tris-HCl緩沖液)的條件下可被DEAE- Sepharose Fast Flow陰離子交換柱(2.6 cm × 20 cm)吸附。調整酶液pH為9.5，離子濃度為20 mmol/L，采用系統泵進樣400 mL，用pH 9.5、20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液進行吸附，然后用含NaCl線性梯度(0～1 mol/L)的Tris-HCl緩沖液洗脫12個柱體積，流速為1.0 mL/L。每管收集5 mL，在280 nm波長下檢測蛋白含量，測定酶活。收集有酶活性部分，經透析脫鹽后冷凍干燥保存待用。

1.2.4 蛋白質電泳

根據預試驗可知，堿性電泳法無法有效分離深山含笑POD，在高pH條件下，部分POD殘留于加樣孔和未進入濃縮膠；部分POD未進入分離膠；而酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳[10]可以實現良好分離。

1.2.5 POD酶活性、蛋白含量測定

參考Amako等[11]的方法并稍修改，測定體系為4 mL，包括1 mL 40 mmol/L愈創木酚，1 mL 40 mmol/L H2O2，1.9 mL 100 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(pH6.0)。加入0.1 mL酶液后啟動反應，于波長470 nm，30 ℃下記錄OD值變化。1個酶活性單位定義為測定條件下每分鐘OD470變化0.1所需的酶量。蛋白質含量測定采用Bradford染色法[12]，以牛血清蛋白作標準蛋白。

1.2.6 POD酶學性質研究

取真空冷凍干燥的酶粉以適量緩沖液溶解后，進行酶的溫度穩定性、最適溫度、酸堿穩定性、最適pH等酶學性質的研究，參照洪健等[13]的方法。

1.2.7 研究不同酶活性、pH、溫度、H2O2濃度以及反應時間對BPA清除的影響

采用50 mL棕色瓶中避光反應，配制20 mL反應混合溶液。反應體系配制如下：準確移取一定量BPA標準儲備液及pH緩沖溶液于50 mL棕色瓶中，加入一定量的深山含笑葉POD，使反應體系總體積達到20 mL，并在恒溫水浴鍋中保溫一段時間后，再加入一定量H2O2并同時計時，分別在1、3、5、15、45、90、120、180 min取樣。取樣時加入甲醇終止反應。待取樣完成后，加入適量濃度為10 mg/mL的硫酸鋁鉀母液，過夜沉淀后離心取上清。采用高效液相色譜-飛行時間質譜聯用法(UPLC-TOF-MS)測定上清液中BPA濃度。

1.3 分析方法

1.3.1 色譜分析條件

Agilent公司ZORBAX C18(2.1×50 mm,1.8 μm)色譜柱。流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，35%乙腈等度洗脫，柱溫25 ℃，體積流量0.2 mL/min。

1.3.2 質譜分析條件

ESI離子源負模式，干燥氣溫度350 ℃，流速10 L/min；霧化器壓力45 psig，毛細管電壓3 500 V，毛細管出口電壓150 V，錐孔電壓65 V，采集速度1.5 spectra/s，選擇離子(EIC)采集方式，選定的分子離子[M-H]-的質荷比為227(BPA)。

1.3.3 酶純度分析方法

測定酶活性及蛋白質含量后，酶的純化倍數采用以下公式計算：

S=U/C

公式1

M=C×V

公式2

F=S1/S0

公式3

Y=M1/M0

公式4

注：(1)S指酶的比活力(U/mg)，S1指純化后酶的比活力，S0指粗酶比活力；

(2)U指酶的活性單位(U/mL)；

(3)C指酶蛋白的濃度(mg/mL)；

(4)M指酶蛋白含量(mg)，M1指純化后總蛋白含量，M0指粗酶總蛋白含量；

(5)V指酶液的體積(mL)；

(6)F指酶的純化倍數；

(7)Y指酶蛋白的回收率(%)。

圖3 結合態POD的DEAE-Sepharose FF柱層析分離Fig.3 Chromatographic pattern of the BPOD from DEAE-Sepharose FF

2 結果與分析

2.1 POD分離純化

深山含笑葉片經勻漿、過濾、離心后經過雙水相萃取除色素、透析后的酶液，進行DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析，得到3個峰，峰1具有酶活性，但峰2和峰3酶活性極低(圖3)。收集峰1，得到純化后的POD，純化倍數為5.5倍，相對SPOD純化倍數為55.2倍(表1)，RZ值可達1.0左右。對該純酶進行非變性垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis，N-PAGE)及SDS-PAGE變性電泳，采用聯苯胺和考馬斯亮藍分別染色，顯示得到單條同工酶帶，其分子量大約為44.51 KD(圖4)。

圖4 深山含笑葉片POD同工酶活性電泳(A)及SDS變性電泳(B)Fig.4 Electrophoretogram of peroxidase isoenzyme extracted from leaves of Michelia maudiae Dunn (A:N-PAGE,B:SDS-PAGE,注：a:可溶性POD b:結合態POD c:ATPE d:透析 e&1:DEAE-Sepharose Fast Flow M:標準蛋白。Note:a:SPOD b:BPOD c:ATPE d:dialysis e&1:DEAE-Sepharose Fast Flow M:Marker.

純化步驟Purification step蛋白質Protein(mg)酶活性Activity(U)比活力Specific activity(U/mg)純化倍數Purificationfold酶活回收率Activity yield(%)可溶性POD SPOD600206400344--粗酶液 Crude extract7826656034171100雙水相萃取 ATPE4325884060201.897透析 Dialysis3222924271762.186DEAE-Sepharose FF2.751186189995.619

2.2 POD性質

2.2.1 POD的溫度穩定性

將真空冷凍干燥后的純酶，用適量pH 5.0的乙酸緩沖液溶解，1.5 mL試管分裝在不同溫度水浴中保存，并以20 ℃酶活性作為對照，分別測定不同時間的相對酶活。在80 ℃水浴中保存的純酶，酶活性迅速下降(圖5)，1 h內酶活性下降至15%以下。在70 ℃和80 ℃水浴加熱4 h左右酶活性幾乎全部損失。酶活性在50 ℃水浴加熱下無明顯損失；而在60 ℃水浴1 h，酶活性仍剩余75%。說明深山含笑葉POD熱穩定性較好，不易失活。

圖5 深山含笑葉POD的熱穩定性Fig.5 Stability of temperature of POD from Michelia maudiae Dunn leaf

2.2.2 POD的pH穩定性

將真空冷凍干燥后的純酶，用適量不同pH的緩沖液溶解，在與緩沖液pH值相同的條件下分別測定酶活性(圖6)，可見pH在5.5～9.5之間，深山含笑葉POD酶活性均保持在較高水平，說明深山含笑葉POD酸堿穩定性較好，具有較寬的pH適應范圍。

圖6 深山含笑葉POD的pH穩定性Fig.6 Stability of pH of POD from Michelia maudiae Dunn leaf

2.2.3 POD的最適溫度

反應體系在Carry 100/300比色皿恒溫夾套上保溫，達到預定溫度后，加入0.1 mL酶液，立即測定OD470時間變化率；結果顯示，在50 ℃時POD酶活性較其他溫度下酶活性高(圖7)；表明深山含笑葉POD最適溫度為50 ℃。

圖7 溫度對深山含笑葉POD活性的影響Fig.7 ffect of temperature on activity of POD from Michelia maudiae Dunn leaf

2.2.4 POD的最適pH

以愈創木酚作為底物，由圖8可以看出，在pH4.0～5.5條件下，相對酶活性均高于90%，在pH4.5時達到最高值，表明深山含笑葉POD的最適pH為4.5。

2.3 POD對BPA的清除效應

2.3.1 最佳清除酶濃度確定

取純化酶少量，用適量pH 5.0的乙酸緩沖液溶解，添加溶解后的酶適量使反應體系中的酶活性單位分別達到5 U/mL、10 U/mL、15 U/mL，在pH值為5，H2O2/BPA為2的條件下，將反應混合物置25 ℃的恒溫水浴磁力攪拌器中進行反應。分別在1、3、5、15、45、90、120和180 min取樣，用甲醇和硫酸鋁鉀終止反應，測定BPA濃度。結果(如圖9)顯示酶濃度在15 U/mL時，BPA在反應3 min后，剩余率低于10%，反應90 min后，BPA被完全清除。為了研究POD清除BPA的化學過程，選定15 U/mL為合適的酶濃度實驗條件。

圖8 pH對深山含笑葉POD活性的影響Fig.8 Effect of pH on activity of POD from Michelia maudiae Dunn leaf

圖9 不同酶濃度對深山含笑葉POD清除BPA的影響Fig.9 Effects of different enzyme concentrations on POD from Michelia maudiae Dunn leaf removal of BPA

2.3.2 pH對POD清除BPA的影響

研究不同pH對POD清除BPA的影響，如圖10所示，pH在4.0-7.0條件下，經過3 h清除反應，BPA清除率均達到95%以上；表明深山含笑葉POD在清除BPA時具有較廣的酸性pH范圍；但它們在1 min鐘內達到的清除速率不一致，pH 3.0僅清除36.5%，而pH 7.0 清除率可達92.3%，在pH 3.0-7.0范圍內，1 min內的清除速率隨pH上升而逐漸上升；pH 8.0-11.0條件下，清除率均小于80%；這可能與深山含笑葉POD的最適反應pH及pH穩定性有關，酶的最適pH在4.0～5.5范圍內(圖8)，而酶在pH 5.5～9.5范圍內穩定(圖6)。

圖10 pH對深山含笑葉POD清除BPA的影響Fig.10 Effects of different pH on POD from Michelia maudiae Dunn leaf removal of BPA

2.3.3 溫度對POD清除BPA的影響

研究不同溫度對POD清除BPA的影響，分別在集熱式恒溫加熱磁力攪拌器上操作，控制pH為7.0、酶濃度為10 U/mL、H2O2/BPA摩爾濃度比值為2，反應時間3 h，在此反應體系中，對清除速度，底物完全清除時間進行比較，從圖11可見，在30～40 ℃范圍內，反應3 h，BPA清除率達到90%以上，當溫度達到60 ℃時，BPA清除率下降至53.3%。

圖11 不同溫度對深山含笑葉POD清除BPA的影響Fig.11 Effects of different temperature on POD from Michelia maudiae Dunn leaf removal of BPA

2.3.4 最佳清除H2O2/BPA比值確定

研究H2O2/BPA摩爾濃度比值對POD清除BPA的影響時，設定比值分別為0.2、0.5、0.8、1.2、2、5倍，控制溫度、酶濃度、pH相同，在此條件下，對清除速度、底物完全清除時間進行比較。如圖12所示，當H2O2/BPA摩爾濃度比值為0.2～2的范圍時，反應3 h，BPA清除率可達95%，但1 min內達到的清除速率不同；當比值為2時，BPA清除率可達51%，當H2O2/BPA摩爾濃度比值達到5倍時，1 min內BPA清除率達到55.4%，由于高濃度H2O2抑制酶活性(圖13)，隨后BPA清除速率下降，3 h后BPA清除率為76.7%；確定H2O2/BPA摩爾濃度比值為2倍。

圖12 不同過氧化氫比例對深山含笑葉POD清除BPA的影響Fig.12 Effects of different mole ratio of H2O2 to BPA on POD from Michelia maudiae Dunn leaf removal of BPA注：不同字母表示在P<0.05水平上差異顯著。Note：Values followed by a different letter are significantly different at the 0.05 probability level.

圖13 不同過氧化氫比例對深山含笑葉POD清除BPA后剩余酶活的影響Fig.13 Effects of different mole ratio of H2O2 to BPA on residual POD activity from Michelia maudiae Dunn leaf removal of BPA

3 結論

植物POD與逆境脅迫下植物清除細胞內自由基以及植物次生物質合成等生化過程有密切關系[1]。已有學者研究了不同植物來源POD的性質：皺皮木瓜和日本木瓜的POD有2個最適pH值，分別是5和6～6.5、5和5～6[14]；而純化后的銀杏葉POD最適pH值為5[15]；木蘭科植物厚樸葉POD的反應最適pH為6[13]；它們的最適反應pH較為相近。本研究顯示深山含笑葉POD最適pH為4.5，與木瓜和銀杏葉POD最適pH比較接近，均在酸性pH范圍內。銀杏葉POD經50 ℃熱處理30 min后活性剩余50%，而SBP[16]在75 ℃時保溫1 h仍可保持較高活力，90 ℃下加熱1 h活性仍未完全消失。本研究中，深山含笑葉片 POD在50 ℃以下水浴5 h，酶活性無明顯損失，在60 ℃以下水浴加熱2 h，剩余酶活力達60%以上；與熱穩定性超高的大豆POD比較接近，說明深山含笑葉片POD耐熱性較好，有利于實際生產應用。

金銀花POD催化愈創木酚氧化的最適反應溫度為30 ℃左右[17]；銀杏葉POD酶促反應最適溫度為37 ℃，隨著溫度升高，酶活力逐漸下降；溫度對厚樸葉片POD活力影響較小，隨溫度升高酶活力下降緩慢，75 ℃保溫60 min后仍然保持70%酶活性[13]，本研究中同為木蘭科植物的深山含笑葉POD最適反應溫度為50 ℃，在60 ℃中保溫1 h，酶活性仍剩余75%，兩者具有相似性，而藕帶中POD在80 ℃下酶活性基本喪失[18]；顯示不同植物來源POD的熱穩定性差異較大。

杜紅霞[19]探討了HRP和雙氧水對BPA的降解性能。實驗結果表明，該酶促反應的最適溫度為25 ℃ ；最適pH值為6；H2O2/BPA最佳比例為2:1(摩爾比)；經過120 min；0.5 U/mL HRP對BPA的降解效果最好。Duarte-Va'zquez等[20]研究了蘿卜過氧化物酶(Turnip Peroxidase，TP)對酚類物質的清除效果，結果顯示，在pH4～8，溫度25 ℃，H2O2濃度0.8 mmol/L條件下，經過3 h，1.28 U/L TP對0.5 mmol/L酚類物質BPA清除率可達85%；本研究中，在pH4～7，溫度30～40 ℃，H2O2/BPA值為2的條件下，經過3 h，10 000 U/L深山含笑葉POD對0.2 mmol/L BPA清除率可達90%以上。與Duarte-Va'zquez的研究結果類似，具有較寬的酸性pH范圍及良好的溫度適應性，表明深山含笑葉POD具有工業化應用的前景。本研究中，H2O2/BPA濃度之比達0.8以上時，深山含笑葉POD對BPA清除率顯著提高，這一結果與來自HRP和SBP的研究結論是一致的[11,21]。同時，當處于高濃度過氧化氫條件下時，酶清除BPA的速率明顯降低，與Flock等[5]研究的高濃度H2O2導致SBP對3-氯酚清除率持續下降結果具有一致性，工業應用時應注意高濃度H2O2對酶活性的抑制作用。

綜上所述，經過非離子表面活性劑抽提、雙水相萃取、DEAE-Sepharose FF層析分離，首次從深山含笑葉片分離提純得到一種熱穩定性較高的BPOD，該酶的比活力可達18999 U/mg蛋白，該酶在pH4～7，溫度30～40 ℃，H2O2/BPA摩爾濃度之比達0.8條件下，對BPA清除率達90%以上。相對于HRP、TP以及SBP等POD，在清除BPA上，深山含笑葉POD具有更寬的pH和溫度適應范圍以及更高的清除率；且在本研究中采用雙水相萃取法，具有容易工業放大、生物相容性好等特點，酶活性回收率高(見表1)，顯示了深山含笑葉POD將來應用于EDCs污染治理的巨大潛力。由于游離酶催化的酚類物質降解反應會導致酶活性逐步喪失，利用酶工程技術進一步探索深山含笑葉POD的固定化途徑，可以為其工業應用提供技術支撐，從而為深山含笑葉經濟價值的有效實現提供保障，促進深山含笑綜合價值的可持續利用。