蛋白水解物制備工藝及其在生物技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用研究進(jìn)展

張邵博，靳冬武，李明生*

1西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院；2甘肅省動物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心；3蘭州民海生物工程有限公司,蘭州 730030

蛋白水解物是蛋白質(zhì)經(jīng)酶、酸、堿和發(fā)酵等方法水解得到的混合物，其主要成分為肽類，還包含少量氨基酸、糖類、脂類、礦物質(zhì)和維生素等物質(zhì)[1]。蛋白水解物的水解效果通常用水解度來評價，但根據(jù)其用途評價指標(biāo)也有所不同，在無血清培養(yǎng)基中主要以氨基酸含量，肽鍵數(shù)為指標(biāo)，在ACE抑制肽中主要以ACE酶的抑制率為指標(biāo)，蛋白水解物的抗氧化活性主要以其抗氧化肽含量為評價指標(biāo)[2]，腦蛋白水解物注射液以各游離氨基酸和總游離氨基酸的含量為評價指標(biāo)[3]等。圖1為蛋白質(zhì)水解為多肽或氨基酸的結(jié)構(gòu)圖。

圖1 蛋白質(zhì)水解結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The structure pattern of protein hydrolysis process

1880年Nagelli等[4]人最先將蛋白水解物用在生物技術(shù)領(lǐng)域，即微生物培養(yǎng)。1900年蛋白水解物成為Vogoes-Proskauer 和McConkey培養(yǎng)基中的重要成分[5]。在1914年Difco實驗室將蛋白胨用在細(xì)菌培養(yǎng)基中[5]。2000年Heidemann等[6]人采用酶解及其下游工藝純化蛋白水解物并應(yīng)用在生物技術(shù)領(lǐng)域中。隨后，蛋白水解物在生物技術(shù)領(lǐng)域中使用更為廣泛。

20 世紀(jì) 70 年代Mizrahi[7]研究發(fā)現(xiàn)蛋白水解物對動物細(xì)胞培養(yǎng)是有利的，能夠提高蛋白或藥物表達(dá)系統(tǒng)的性能。目前，研究表明，蛋白水解物除了為動物細(xì)胞增殖提供普通的氮源以外，還能夠提供多種營養(yǎng)成分、貼壁因子及生長因子類似物等[6]，可用于無血清或低血清培養(yǎng)基中支持動物/昆蟲細(xì)胞生長、提高目標(biāo)產(chǎn)物表達(dá)量。Franek等[8-10]研究表明蛋白水解物中存在不同分子量的活性短肽，這些肽段可作為外部分子信號從而影響細(xì)胞的增殖和代謝，并能促進(jìn)細(xì)胞生長，提高細(xì)胞活力。

本文主要從蛋白水解物制備工藝的研究概況、蛋白水解物在生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用、蛋白水解物對細(xì)胞代謝增殖的影響以及在細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用的優(yōu)缺點出發(fā)，對蛋白水解的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 蛋白水解物制備工藝的研究概況

微生物培養(yǎng)基中的蛋白水解物的制備工藝已有幾十年的歷史，其基本的生產(chǎn)工藝基本穩(wěn)定并且?guī)缀醣３忠恢隆５S著蛋白水解物的應(yīng)用范圍越來越廣泛，尤其是在動物細(xì)胞培養(yǎng)的個性化培養(yǎng)基中的應(yīng)用，其生產(chǎn)工藝也有了顯著的提高。目前，其工藝處在尋找特異性肽類的起步階段，該工藝及其應(yīng)用的預(yù)期效果是得到單個氨基酸的混合物和特異性生物活性肽。這將成為蛋白水解物生產(chǎn)廠商和最終用戶共同努力開發(fā)針對特定應(yīng)用的最佳水解蛋白的制備工藝。

1.1 蛋白水解物基本水解方法

目前，蛋白水解物的制備方法主要有酸水解法，堿水解法和酶水解法。酸水解法是利用鹽酸在一定溫度條件下水解一段時間再用堿中和。水解成本低、水解徹底、反映迅速、生產(chǎn)周期短，產(chǎn)物幾乎不被消旋，酸水解會破壞色氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺等敏感氨基酸，部分糖也會被破壞導(dǎo)致水解液顏色呈現(xiàn)棕黑色，酸水解蛋白原料過程中會產(chǎn)生具有毒性和致癌性的氯丙醇[11]。堿水解法水解蛋白質(zhì)色氨酸穩(wěn)定，但水解后氨基酸會消旋，使L型氨基酸變成D型，水解率低，易產(chǎn)生尿素等不利物質(zhì)，尤其胱氨酸和半胱氨酸易損失，酸堿水解法不存在專一性。酶水解法水解位點特定，可以有選擇的水解某些特定的氨基酸肽鍵，用于一級結(jié)構(gòu)，安全性高、反應(yīng)條件溫和、副反應(yīng)少、不破壞敏感氨基酸、水解產(chǎn)物在營養(yǎng)、風(fēng)味、工藝等方面均優(yōu)于酸、堿水解法[12,13]。

1.1.1 酸水解法

Braconnot在1820年第一次報道。該方法主要是用在食品領(lǐng)域中，主要是增加和改善食品的風(fēng)味[14]。在生物技術(shù)領(lǐng)域中只占一小部分。酸水解最常用的是硫酸水解或鹽酸水解，在蛋白質(zhì)水解過程中，有一些必需氨基酸被破壞，例如色氨酸，蛋氨酸，胱氨酸、半胱氨酸等，谷氨酰胺和天冬酰胺進(jìn)一步的被轉(zhuǎn)化為谷氨酸和天冬氨酸[15]。更顯著的是酸水解破壞了蛋白質(zhì)中的特有氨基酸或者短時間內(nèi)破壞了大量的小分子肽。除此之外，酸水解過程中鹽含量顯著的增加，脫鹽等疑難問題在下游技術(shù)中需要解決。通常酸水解的酪蛋白和大豆蛋白用于診斷和發(fā)酵培養(yǎng)基中[16]。

1.1.2 堿水解法

在生物技術(shù)領(lǐng)域中堿水解法使用很少，在水解過程中有些蛋白質(zhì)被破壞，如絲氨酸和蘇氨酸，但色氨酸是完整的。張憶華等采用微波堿水解法水解了全脂豆粉，水解時間由常規(guī)方法的20多個小時縮短為55秒，同時檢測了水解產(chǎn)物的色氨酸和酪氨酸的含量[17]。

1.1.3 酶水解法

目前有大量的動物、植物和微生物蛋白質(zhì)可用多種酶進(jìn)行酶解，并使用于生物技術(shù)領(lǐng)域中，近幾年，發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶水解蛋白質(zhì)技術(shù)被大量學(xué)者研究。酶解蛋白質(zhì)的主要優(yōu)勢是水解條件溫和，制造商能夠精確控制蛋白質(zhì)水解物的水解度，從而滿足不同的用戶。蛋白質(zhì)水解常用的蛋白酶有動物源性蛋白酶、植物源蛋白酶、微生物源性蛋白酶。動物蛋白酶主要有胰酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等，植物蛋白酶主要有木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶，還有細(xì)菌和真菌性蛋白酶屬于微生物酶，表1為蛋白酶舉例。蛋白質(zhì)的水解可以用單酶來完成，也可以采用多種酶連續(xù)水解的方法來完成。酶的選擇經(jīng)常依賴于蛋白質(zhì)的來源和最終用戶的要求。例如，蛋白質(zhì)中含有較高濃度的疏水性的氨基酸，在酶選擇時就要選擇能夠特異性水解疏水性氨基酸的酶[18]。

除了酸、堿、酶水解蛋白質(zhì)以外，蛋白水解物制備的一個新趨勢是采用發(fā)酵法水解蛋白并得到游離氨基酸和多肽、短肽[23]。微生物發(fā)酵法是較為傳統(tǒng)的食品加工手段，包括液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵。其生產(chǎn)工序相對簡單，經(jīng)發(fā)酵后可提升原料蛋白的溶解性、乳化性、起泡性等特性。

1.2 蛋白水解物制備工藝流程

根據(jù)蛋白水解物和產(chǎn)品類型的不同，其工藝流程也略有不同，圖2為蛋白水解制備的一般工藝流程。

根據(jù)圖2可以看出，水解蛋白質(zhì)的方法不同，其控制條件也不一致。靳冬武等[24]以游離氨基酸含量為指標(biāo)，采用超高壓協(xié)同酶解的方法對酪蛋白進(jìn)行水解。通過單因素試驗，考察了底物濃度、水解溫度、水解pH對氨基酸含量的影響，結(jié)果證明隨著底物濃度的增加氨基酸含量也隨之增加，隨著水解壓力的增加氨基酸含量呈先增后減的趨勢，隨著水解溫度的上升氨基酸含量呈先增后減的趨勢，隨著水解 pH的增加氨基酸含量呈先增后減的趨勢。張健[25]等采用高壓技術(shù)水解卵清蛋白，在單因素試驗基礎(chǔ)上采用正交實驗的方法對高壓酶解卵清蛋白的工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，隨著壓力的增加，卵清蛋白的水解度呈上升趨勢，150 MPa 時水解度達(dá)到最大；水解溫度的升高，水解度的變化極其明顯，50解時達(dá)到最大；水解度隨pH升高在一定范圍內(nèi)逐漸升高，但變化不明顯；隨酶濃度增加，水解度變化極其明顯且呈升高趨勢，以水解度為標(biāo)準(zhǔn)正交試驗確定最佳水解工藝為：水解壓力120 MPa，水解溫度50解，水解pH =7.0，酶與底物比(E/S) =1∶2.5。眾多試驗結(jié)果表明，水解度受多因素影響，水解條件的確定應(yīng)綜合壓力、溫度、pH、酶與底物濃度的比值等條件篩選最優(yōu)條件得到理想的水解產(chǎn)物。在酶解蛋白質(zhì)的工藝中，要隨時監(jiān)控體系的pH和溫度。這主要與酶的性質(zhì)有關(guān)，在酶的最佳條件下酶才能發(fā)揮最好的作用，這樣不會造成酶的浪費，并且可以縮小批間差異。

表1 蛋白酶種類及其特性舉例

圖2 典型蛋白水解物工藝流程圖Fig.2 Typical manufacturing overview of protein hydrolysates

1.3 蛋白水解物制備過程中的質(zhì)量控制

要得到質(zhì)量好、穩(wěn)定性好、批間差異小的高質(zhì)量蛋白水解物，在制備過程中嚴(yán)格控制生產(chǎn)環(huán)境、嚴(yán)格監(jiān)控每一操作工藝等尤為重要。應(yīng)嚴(yán)格遵守2015年版《中華人民共和國藥典》生物制品通則對生產(chǎn)和質(zhì)量管理規(guī)范的原則性要求，包括：生物制品生產(chǎn)用原材料及輔料的質(zhì)量控制規(guī)程、生物制品生產(chǎn)和檢定用動物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程、生物制品分裝和凍干規(guī)程、生物制品貯藏和運輸規(guī)程等[26]。

蛋白水解物的質(zhì)控要點主要有1)嚴(yán)格遵守GMP規(guī)程；2)保持車間的衛(wèi)生；3)原材料和供應(yīng)商的篩選，獲得高質(zhì)量，批間差異小、穩(wěn)定性好、一致性強的原材料；4)生產(chǎn)過程抽樣監(jiān)測保持一致性；5)干燥過程中干燥開始與干燥結(jié)束時的樣品保持一致；6)不斷的檢測蛋白、酶、水以及下游工藝能影響產(chǎn)品質(zhì)量的各個環(huán)節(jié)。

1.4 蛋白水解物制備下游工藝

下游制備工藝是對初步水解產(chǎn)物的分離純化。蛋白質(zhì)水解物經(jīng)過簡單分離步驟后其清亮度差、溶解度低，不能直接添加于干粉培養(yǎng)基和動物細(xì)胞培養(yǎng)基中。此外，忽略對蛋白水解物中內(nèi)毒素含量的檢測和控制，可能對細(xì)胞培養(yǎng)過程中后期蛋白表達(dá)、疫苗生產(chǎn)等帶來巨大的浪費和損失，羅非君[27]等研究表明，內(nèi)毒素能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，細(xì)胞吞噬機(jī)能顯著下降(P<0.01)。因此通過下游工藝對蛋白水解物進(jìn)行優(yōu)化尤為關(guān)鍵。表2[28]、圖3列舉了蛋白水解物下游工藝主要方法。

表2 蛋白水解物下游工藝處理方法

注：A、B、C、D分別為板框壓濾、連續(xù)離心、超濾、層析。

Note：A.Plate and frame filter press,B.Centrifuge,C.Ultra filtration system,D.Chromatography.

圖3 蛋白水解物下游工藝設(shè)備Fig.3 The downstream process instruments of protein hydrolysates

總之，蛋白水解物制備工藝基本穩(wěn)定，但在制備特異性肽類還處于起步階段。要得到質(zhì)量好、穩(wěn)定性好、批間差異小的高質(zhì)量蛋白水解物，制備過程中生產(chǎn)環(huán)境、嚴(yán)格操作生產(chǎn)工藝步驟尤為重要。

2 蛋白水解物在生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用概況

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，蛋白水解物在生物技術(shù)領(lǐng)域中使用越為廣泛。近年來，蛋白水解物作為氮源和營養(yǎng)成分使用在分子生物學(xué)、微生物學(xué)、動物細(xì)胞的培養(yǎng)、昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)、植物細(xì)胞的培養(yǎng)。

2.1 蛋白水解物在哺乳動物細(xì)胞蛋白表達(dá)中的應(yīng)用

由于哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后修飾，哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在蛋白表達(dá)產(chǎn)品中使用最為普遍[29]。目前，中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary，CHO)細(xì)胞能夠正確的轉(zhuǎn)錄后修飾，并且在大規(guī)模的工業(yè)化生物反應(yīng)器無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)中有很好的適應(yīng)性，幾乎60%～70%的重組蛋白在CHO細(xì)胞中成功的表達(dá)[30]。通常采用含有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO細(xì)胞或者是未分泌蛋白的小鼠骨髓瘤(NSA)細(xì)胞并表達(dá)和生產(chǎn)蛋白質(zhì)，包括單克隆抗體。因此，1972年和1974年Taylor學(xué)者[31,32]開始采用蛋白水解物代替血清培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行了研究。在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基中添加蛋白水解物能夠促進(jìn)細(xì)胞生長，并提高目標(biāo)蛋白的產(chǎn)率。

Chun BH等[33]研究了不同水解物對CHO DG44細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響，結(jié)果顯示分批培養(yǎng)最大細(xì)胞密度為不添加水解物對照組的106%至144%，其中添加大豆水解產(chǎn)物組的最大細(xì)胞密度和生長速率均高于其他水解產(chǎn)物。 Sung YH等[34]研究了重組中國倉鼠卵巢(rCHO)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)表達(dá)人血小板生成素(hTPO)，在無血清培養(yǎng)基(SFM)中添加酵母水解產(chǎn)物(YH)，YH對hTPO表達(dá)的正面影響極其顯著，當(dāng)5g/LYH加入SFM時，分批培養(yǎng)的最大hTPO濃度為40.41μg/mL，是不加YH的SFM的11.5倍。Franek 等[35]研究指出，大豆蛋白水解物分離組分及小麥蛋白水解物分離組分能顯著提高雜交瘤細(xì)胞ME-750 密度及單克隆抗體的產(chǎn)量，其最高值分別為無血清對照組的180% 及239%。Pham PL等[36]研究表明添加明膠蛋白胨N3的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的HEK293SF-3F6細(xì)胞系的蛋白表達(dá)量提高了四倍。Heidemann R等[37]研究表明，在培養(yǎng)基中添加高濃度蛋白胨提高了重組BHK細(xì)胞系20%～30%的單位生產(chǎn)率。

2.2 蛋白水解物在昆蟲細(xì)胞蛋白表達(dá)中的應(yīng)用

在昆蟲細(xì)胞中桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)是蛋白表達(dá)常用的工藝過程，有一些系統(tǒng)采用了(Spodoptera frugiperda,Sf-9)細(xì)胞表達(dá)蛋白并使用了含有水解乳蛋白的培養(yǎng)基[38]。許多昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中含有胎牛血清，是培養(yǎng)基中最為昂貴的成分。由于血清的批間差異，可能含有細(xì)胞毒性成分，病毒、支原體等對細(xì)胞的影響最大。并且會引起泡沫、下游蛋白純化復(fù)雜等問題。進(jìn)一步說，血清并不是昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)中的必須成分，而在無血清培養(yǎng)基中添加一些蛋白胨或水解乳蛋白更為有效。蛋白胨是培養(yǎng)基中主要的氨基酸來源，其中水解乳蛋白是最廣泛應(yīng)用的添加劑，通常和酵母提取物一起被添加到各種昆蟲培養(yǎng)基中。水解乳蛋白對昆蟲細(xì)胞的作用不是與其含量成正相關(guān)的，其濃度一般在0.2%～0.5%之間對昆蟲細(xì)胞有促生長作用[39]。

2.3 蛋白水解物在疫苗中應(yīng)用

由于牛血清可能會引起朊病毒病疾病(BSE會感染大腦中大神經(jīng)元)，從而在疫苗生產(chǎn)中使用牛血清已被輕視。因此，在無動物源性的疫苗生產(chǎn)用的培養(yǎng)基成分中動物源性的材料(血清、動物源性蛋白水解物)逐日被植物蛋白水解物代替。例如，在破傷風(fēng)毒素的制備中，為了破傷風(fēng)梭菌的免疫和增殖，在傳統(tǒng)培養(yǎng)基中添加肉提取物、腦心浸液，酪蛋白水解物等動物源性的材料，但經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)在類毒素中經(jīng)常有動物的加成化合物。為了解決這個問題，在新的培養(yǎng)基中添加了植物蛋白水解物并培養(yǎng)了破傷風(fēng)梭菌，從而發(fā)現(xiàn)其增殖、收率和滴度就高于含有原來傳統(tǒng)的含動物源性蛋白的培養(yǎng)基[40-42]。

2.4 蛋白水解物在微生物細(xì)胞中的應(yīng)用

培養(yǎng)基中不同氮源會對微生物細(xì)胞的增值和代謝途徑產(chǎn)生影響。腸道細(xì)菌的組成和代謝均會受到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及氨基酸組成的影響，劉藝端等[43]研究了以豆粕、菜粕或魚粉水解物上清液為氮源的不同蛋白源對小腸微生物代謝的影響，結(jié)果表明，空腸組和回腸組氨氮濃度和菌體蛋白濃度均相對增加，尤其是酶解菜粕組菌體蛋白合成量較高，十二指腸組菌體蛋白濃度以及氨氮含量不斷減少，能夠轉(zhuǎn)化乳酸并大量產(chǎn)生丁酸和丙酸，丁酸是腸道上皮細(xì)胞的重要能量來源，同時能夠促進(jìn)腸道黏蛋白的生成。高海燕[44]研究表明，用乳清蛋白水解物分別等量替代MRS培養(yǎng)基中的蛋白胨或牛肉粉對保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌以及雙歧桿菌的培養(yǎng)效果較好，生長量及生長趨勢均可達(dá)到市售MRS培養(yǎng)基及自配MRS培養(yǎng)基的水平甚至更優(yōu)。左偉勇[45]研究表明，伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肚是良好的雙歧桿菌促增殖因子，能夠促進(jìn)雙歧桿菌增殖,并且優(yōu)于等氮量的伴大豆球蛋白,不僅具有營養(yǎng)功能,而是發(fā)揮了某種調(diào)節(jié)作用。

2.5 蛋白水解物在植物細(xì)胞蛋白表達(dá)中的應(yīng)用

紫杉醇是通過植物細(xì)胞培養(yǎng)制得的一種重要的產(chǎn)品，是最為成功的抗癌藥物之一。它是通過紅豆杉細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)制備所得。2000年Choi等[46]的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中含有酪蛋白水解物，而在2002年張等[47]的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中含有水解乳蛋白。

2.6 蛋白水解物在初級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)中的應(yīng)用

初級代謝產(chǎn)物工業(yè)化生產(chǎn)是微生物的最主要的貢獻(xiàn)之一，例如氨基酸、維生素、呈味核苷酸等。許多代謝產(chǎn)物的發(fā)酵工藝中都能利用蛋白水解物。例如L-谷氨酸的制備是工業(yè)化生產(chǎn)最大的初級代謝產(chǎn)物，每年能生產(chǎn)150萬噸。2006年Kataoka等[48]在生產(chǎn)L-谷氨酸時在培養(yǎng)谷氨酸棒狀桿菌的商業(yè)化培養(yǎng)基中添加了大豆蛋白水解物。

3 蛋白水解物對細(xì)胞代謝、增殖的影響

蛋白水解物在動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中作為完全培養(yǎng)基的組成成分或在生物反應(yīng)器批培養(yǎng)的重要成分而被普遍利用。如果細(xì)胞生長在游離氨基酸中，只能通過游離氨基酸的運輸系統(tǒng)才能進(jìn)入到細(xì)胞體內(nèi)被細(xì)胞吸收。但細(xì)胞生長在含有多肽和游離氨基酸的培養(yǎng)基中時，游離氨基酸和多肽進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)，由細(xì)胞本身所攜帶的酶水解并以短肽和氨基酸的形式被細(xì)胞吸收，從而影響細(xì)胞的整體代謝[49]，具體見圖1-4所示。

由于蛋白水解物中含有多種活性因子和營養(yǎng)成分，這從根本上改善培養(yǎng)體系的整體性能，進(jìn)而影響細(xì)胞代謝、增殖、生物合成和蛋白表達(dá)[1]。1999年Nyberg等[50]研究表明采用含有動物組織水解物PrimatoneTMRL的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO細(xì)胞過程中，從多肽中釋放出的氨基酸數(shù)量有顯著變化。這充分證明，蛋白水解物能對細(xì)胞生長和細(xì)胞蛋白的生產(chǎn)有明顯的正面影響。Bonarius HPJ等[51]對雜交瘤細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)中的胞內(nèi)代謝通量，氨基酸、葡萄糖的消耗率和乳酸、氧氣、CO2和NH4+的生成率以及在含有動物組織水解物和無蛋白水解物的培養(yǎng)基中對細(xì)胞內(nèi)氨基酸的通量和單克隆抗體產(chǎn)率進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，細(xì)胞密度增加兩倍以上，單克隆抗體的產(chǎn)量增加50%，整個氨基酸的組成是正常培養(yǎng)基的兩倍。

圖4 細(xì)胞吸收蛋白水解物模式圖Fig.4 The pattern of cell absorption protein hydrolysates

本實驗室研究了酪蛋白水解乳蛋白對細(xì)胞生長的影響，在BHK-21貼壁細(xì)胞中進(jìn)行了應(yīng)用，以含有0.25%酪蛋白水解乳蛋白(45%MEM,45%歐氏液，10%FBS)為培養(yǎng)基，培養(yǎng)BHK-21貼壁細(xì)胞。同時以MEM培養(yǎng)基為空白組，含有0.25%Hyclone水解乳蛋白的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照組。連續(xù)培養(yǎng)10代，結(jié)果顯示BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)24 h時空白組、試驗組和對照組的細(xì)胞均能生長至50%以上；在48 h均生長成致密單層，細(xì)胞生長正常，形態(tài)良好。但在24 h試驗組和對照組的細(xì)胞密度明顯高于空白組。這說明Hyclone水解乳蛋白和超高壓酶解酪蛋白產(chǎn)物對BHK-21細(xì)胞均有促生長作用。

蛋白水解物對細(xì)胞生長有明顯的影響其原理并沒有合理的解釋，Sxhlaeger等[52]研究表明，蛋白水解物作為HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染的激活因子，它不但是一種重要的營養(yǎng)成分而且具有抗細(xì)胞凋亡功能[53]。目前培養(yǎng)基中添加蛋白水解物后其中的游離氨基酸有可能會改變細(xì)胞中葡萄糖，乳酸和氨的代謝，從而引起在不同系統(tǒng)中有不同的反應(yīng)[54-56]。Davami等[33]對在rCHO細(xì)胞中分別添加了幾種大豆蛋白水解物和酪蛋白水解物，對其代謝情況進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，不同的蛋白水解物對rCHO細(xì)胞的代謝有不同的影響。2015年Hu等[57]在CHO細(xì)胞中表達(dá)Fc融合蛋白并研究了酵母水解物對細(xì)胞胞內(nèi)效應(yīng)的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加酵母水解物之后，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)被激活從而增強Fc融合蛋白的翻譯，F(xiàn)c融合蛋白翻譯后的步驟變的緩慢。Frenek,Sung等[58,59]研究表明植物蛋白水解物和酵母水解物中含有促細(xì)胞生長因子類的肽類和抗細(xì)胞凋亡的多肽。Nyberg，Heidemann R等[50,60]研究表明植物蛋白水解物作為氨基酸資源在細(xì)胞培養(yǎng)中營養(yǎng)更好。生物活性化合物作為營養(yǎng)添加劑可以提高細(xì)胞能量代謝的效率。例如1992年Daniel等[61]解釋，小分子肽類以完整形式被細(xì)胞吸收并隨后水解的效率明顯高于游離氨基酸的吸收效率。這樣的話，更多的氨基酸可以用于促進(jìn)細(xì)胞生長而不僅僅是提供能量。2012年Luo進(jìn)一步研究表明，蛋白水解物中存在礦物質(zhì)，通過銅的添加表明，蛋白水解物可以提高氧化代謝。1996年Bonarius等[51]還發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加蛋白水解物后，細(xì)胞內(nèi)磷酸戊糖途徑流量加快。NADPH產(chǎn)生量增加，細(xì)胞合成代謝增強，TCA循環(huán)速率加快。Chun等[62]研究表明，蛋白水解物可以促進(jìn)細(xì)胞生長，并且可以減少碳源的消耗和乳酸的生成，但氨的生成會略有增加。Burteau 等[63]學(xué)者強調(diào)，當(dāng)葡萄糖消耗完后，乳酸被植物蛋白水解物觸發(fā)被作為碳源從而被細(xì)胞所利用。這些研究均表明，蛋白水解物會影響細(xì)胞代謝主要依賴于培養(yǎng)基。因此，有許多學(xué)者研究了蛋白水解物對細(xì)胞代謝的動力學(xué)。

總之，蛋白水解物在細(xì)胞培養(yǎng)中的代謝機(jī)制尚不明確，近年來，有許多的學(xué)者對其細(xì)胞代謝機(jī)制的影響進(jìn)行研究。但研究表明，由于水解物的來源及生產(chǎn)工藝不同，導(dǎo)致其氨基酸組成、肽段分子量大小及結(jié)構(gòu)不同，因而對細(xì)胞生命活動產(chǎn)生影響也有所不同[1]，但基本都能夠?qū)?xì)胞代謝有正面的影響。因此，蛋白水解物是無血清培養(yǎng)基或低血清培養(yǎng)中的很好的一種營養(yǎng)添加劑。

4 蛋白水解物在細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用的優(yōu)缺點

許多研究結(jié)果表明，蛋白水解物作為培養(yǎng)基中的添加劑不但可以提供營養(yǎng)成分促進(jìn)細(xì)胞增殖，而且可以提高蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)率。但蛋白水解物在應(yīng)用中仍有局限性。以下為蛋白水解物在細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用的優(yōu)缺點。

4.1 蛋白水解物在細(xì)胞培養(yǎng)中的優(yōu)點

蛋白水解物的使用代替了血清添加成分，作為基礎(chǔ)營養(yǎng)成分為無血清培養(yǎng)基開發(fā)技術(shù)提供了可靠的解決方案。推動了個性化無血清培養(yǎng)基的研制進(jìn)程。無血清培養(yǎng)基研制比較費時并且很有難度。向DMEM、MEM、DM/F12等基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加適量的蛋白水解物制備個性化或普通無血清培養(yǎng)基，能夠加快無血清培養(yǎng)基的研制進(jìn)程。

蛋白水解物作為無血清培養(yǎng)基的補充劑或基礎(chǔ)配方，為無血清培養(yǎng)基的快速開發(fā)技術(shù)提供了一個臨時的解決方案。雖然蛋白水解物中的化學(xué)成分尚不明確并存在一定的變量，但蛋白水解物提供了許多有益的因素，例如減少了添加血清帶來的相關(guān)風(fēng)險，避免血清蛋白酶對目標(biāo)產(chǎn)物的分解、簡化下游工藝的相關(guān)步驟、消除血清潛在的免疫原性及病毒微生物污染，減少制藥工業(yè)的風(fēng)險[1]。此外，蛋白水解物作為無血清培養(yǎng)基的基本成分可應(yīng)用與貼壁依賴性細(xì)胞和非貼壁依賴性細(xì)胞[64-66]。

蛋白水解物以干粉形式可以儲存在低溫條件下，一般都是大批量生產(chǎn)，可以控制原材料、制備工藝的一致性和合理性。從而保證了最終使用者所用產(chǎn)品的一致性。減少了無血清培養(yǎng)基的批間差異。從而為審核供應(yīng)商可能會提供一些成本優(yōu)勢。蛋白水解物可以改變生物反應(yīng)器的生產(chǎn)環(huán)境，從而生產(chǎn)出高質(zhì)量、高收益率的生物產(chǎn)品。

4.2 蛋白水解物在細(xì)胞培養(yǎng)中的缺點

動物源的蛋白水解物可為生物制藥行業(yè)帶來支原體、噬菌體、病毒等污染，因此在產(chǎn)品申報及審批過程中會遇到和血清同樣的問題[5]。

蛋白水解物在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加量可能在100 mg/L至5.0 g/L范圍內(nèi)，但在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中所添加的蛋白水解物是否為單獨使用或與其他營養(yǎng)添加劑相結(jié)合。這樣的話，大量可變的生化組成或生物性能可能會影響目的產(chǎn)物的表達(dá)。此外，蛋白水解物的化學(xué)成分不明確，這可能為目的產(chǎn)物的進(jìn)一步分離純化帶來一定的困難。

蛋白水解物的加工過程可能引入一些不利因素，如革蘭氏陰性細(xì)菌的降解會引入一些脂多糖成分，從而改變蛋白水解物中的內(nèi)毒素水平，進(jìn)而會影響目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率及質(zhì)量[1,5]。

此外，蛋白水解物的組成及功效成分不完全明確，對動物細(xì)胞生長及功能的作用機(jī)制尚未深入研究。

5 總結(jié)與展望

綜上，從大量文獻(xiàn)來看，蛋白水解物在生物技術(shù)領(lǐng)域應(yīng)用越發(fā)廣泛，目前蛋白質(zhì)水解物主要應(yīng)用在細(xì)胞蛋白表達(dá)、動植物細(xì)胞代謝增殖、微生物培養(yǎng)、個性化培養(yǎng)基、食品加工業(yè)等方面。蛋白水解物主要成分為肽類，還包含少量氨基酸、糖類、脂類、礦物質(zhì)和維生素等物質(zhì)，可為細(xì)胞生長提供多種營養(yǎng)成分、貼壁因子及生長因子類似物等，可作為非動物源性成分添加至培養(yǎng)基中應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)中。應(yīng)用非動物源性蛋白水解物可以生產(chǎn)安全性更高的生物制品，但由于水解物的來源及生產(chǎn)工藝不同，導(dǎo)致其氨基酸組成、肽段分子量大小及結(jié)構(gòu)不同，因而對細(xì)胞生命活動產(chǎn)生影響也有所不同，目前蛋白水解物在細(xì)胞培養(yǎng)中的代謝機(jī)制尚不明確，是當(dāng)前的研究熱點。