氫醌染毒對(duì)紅白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞周期的影響及其機(jī)制

趙雪，溫緣緣，肖蕓，萬(wàn)秀方，李攀登，王永紅，鄭丹，謝婷婷，張亞莉

(1貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，貴陽(yáng) 550004；2德陽(yáng)市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院；3貴州大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

苯(Benzene)是一種重要的有機(jī)溶劑，被廣泛作為化工原料生產(chǎn)染料、黏合劑、室內(nèi)裝修乳漆[1]、農(nóng)藥等。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)早期研究表明苯為第一類致癌物[2]，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)苯代謝物氫醌(HQ)是其在體內(nèi)的主要毒性物質(zhì)，長(zhǎng)期低濃度接觸HQ可致血細(xì)胞減少、貧血、淋巴瘤等相關(guān)血液性疾病[3]。動(dòng)物試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期接觸HQ可致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨髓和血液毒性及肝損傷[4]；課題組前期體外細(xì)胞研究結(jié)果提示HQ染毒可使白血病細(xì)胞株U937細(xì)胞 DNA 損傷、增殖抑制并誘導(dǎo)凋亡[5]；有學(xué)者表明HQ能使外周血淋巴細(xì)胞及淋巴母細(xì)胞TK6細(xì)胞周期異常，且誘導(dǎo)凋亡[6,7]。細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)是生命體活動(dòng)的重要表現(xiàn)，而細(xì)胞周期紊亂常伴隨異常表現(xiàn)，如細(xì)胞凋亡和腫瘤形成等[8]。通常細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn)受多種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控，如細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)及細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑(CKI)等，這些蛋白異常改變會(huì)對(duì)細(xì)胞周期正常運(yùn)行造成一定影響。紅系細(xì)胞毒性是HQ致骨髓、血液毒性的重要表現(xiàn)之一[9]。目前，關(guān)于苯代謝物HQ對(duì)紅系細(xì)胞周期的影響及相關(guān)機(jī)制仍不明了。2018年3～7月，本研究以紅白血病細(xì)胞株K562 細(xì)胞為體外模型，探究HQ對(duì)K562細(xì)胞周期的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人白血病細(xì)胞株 K562由武漢大學(xué)保藏中心提供；氫醌(HQ)購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；RPMI 1640購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京 Solarbio 公司；細(xì)胞周期蛋白E(CyclinE)、細(xì)胞分裂周期基因25A(CDC25A)、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶2(CDK2)、細(xì)胞周期蛋白A(CyclinA)、p53、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A(p21)及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)兔源多克隆抗體購(gòu)自沈陽(yáng)WanLeibio 公司，GAPDH 兔源多克隆抗體購(gòu)自南京巴傲德公司,LaminB1鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech PTGLAB；流式細(xì)胞儀、蛋白分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 K562 細(xì)胞培養(yǎng)與染毒分組 用含10%胎牛血清完全培養(yǎng)基，于5%CO2、37 ℃ 飽和濕度條件下培養(yǎng)K562細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[5]，設(shè)置空白對(duì)照組(0 μmol/L HQ )和HQ染毒低劑量組(15 μmol/L HQ)、中劑量組(30 μmol/L HQ)、高劑量組(60 μmol/L HQ)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，按細(xì)胞濃度為2×105/mL接種于六孔板培養(yǎng)，空白對(duì)照組、HQ染毒低劑量組、中劑量組、高劑量組分別以HQ終濃度為0、15、30、60 μmol/L處理K562細(xì)胞，重復(fù)間隔染毒細(xì)胞72 h(按照分組以不同濃度HQ處理細(xì)胞24 h后，用PBS洗2次，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后再次用HQ進(jìn)行相同的處理，如此分別處理共3次即為HQ重復(fù)間隔染毒72 h)，收獲細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞周期檢測(cè) 收獲已重復(fù)間隔染毒72 h 的細(xì)胞，制成含1×106個(gè)的細(xì)胞液，用PBS洗滌1次，2 000 r/min離心5 min，棄上清，滴入冷無(wú)水乙醇500 μL固定細(xì)胞(2 h至過(guò)夜)，4 ℃保存。檢測(cè)前，用PBS洗去乙醇，加入500 μL PBS重懸細(xì)胞，加100 μL RNase A于37 ℃水浴30 min，后加400 μL碘化丙啶于4 ℃避光染色30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 收獲已重復(fù)間隔染毒72 h 的細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說(shuō)明，提取總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，小劑量分裝，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩estern blotting 檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinE、CDC25A、CDK2、CyclinA、p53、p21、PCNA(各抗體稀釋比分別為1∶750、1∶1 500、1∶1 500、1∶1 500、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000)的表達(dá)。電泳-轉(zhuǎn)膜后，5% 脫脂牛奶封閉2 h，按上述各抗體濃度稀釋比孵育一抗，4 ℃過(guò)夜，次日取出膜條，1×TBST洗膜3次，每次10 min；取各膜條于二抗孵育盒在室溫孵育2 h，1×TBST洗膜3次，每次10 min，ECL顯影法，用ImageJ圖像軟件分析各蛋白條帶的灰度值。以GAPDH和LaminB1為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 HQ對(duì)K562細(xì)胞周期分布的影響 各劑量HQ間隔染毒K562細(xì)胞72 h 后，與空白對(duì)照組比較，各染毒劑量組G0/G1細(xì)胞比例下降，S期比例增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，G2/M期細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度HQ對(duì)K562細(xì)胞周期分布的影響

注： 與空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與低劑量組比較，bP<0.05。

2.2 HQ對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，低、中、高劑量組CDC25A蛋白的表達(dá)量降低(P<0.05)，與低劑量組比較，中、高劑量組CDC25A蛋白的表達(dá)量降低(P<0.05)；與中劑量組比較，高劑量組CDC25A蛋白的表達(dá)量降低(P<0.05)，CDC25A蛋白隨著HQ濃度的增加，表達(dá)量呈遞減趨勢(shì)。與空白對(duì)照組比較，低劑量組CyclinE蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，中、高劑量組CyclinE蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)；與中劑量組比較，高劑量組CyclinE蛋白的表達(dá)量降低(P<0.05)。與空白對(duì)照組比較，低、中劑量組p53蛋白表達(dá)量增高(P<0.05)，高劑量組p53蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與低劑量組比較，中、高劑量組p53蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)，與中劑量組比較，高劑量組p53蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)。與空白對(duì)照組比較，低劑量組PCNA蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，中、高劑量組PCNA蛋白的表達(dá)量降低(P<0.05)；與低劑量組比較，中、高劑量組PCNA蛋白的表達(dá)量降低(P<0.05)；與中劑量組比較，高劑量組PCNA蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CDK2、CyclinA和p21蛋白在空白對(duì)照組與HQ染毒各劑量組間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同濃度HQ對(duì)細(xì)胞周期蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

注： 與空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與低劑量組比較，bP<0.05；與中劑量組比較，cP<0.05；與高劑量組比較，dP<0.05。

3 討論

有研究報(bào)道HQ代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧可使細(xì)胞DNA氧化損傷，或與DNA形成加合物造成DNA雙鏈斷裂、染色體畸變[10,11]。前期課題組利用HQ染毒K562細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HQ使K562細(xì)胞DNA損傷，且損傷程度呈劑量依耐性[12]。正常情況下細(xì)胞有完整的基因損傷修復(fù)系統(tǒng)，而內(nèi)外因素一旦使細(xì)胞DNA損傷，細(xì)胞隨即啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)機(jī)制，在短期效應(yīng)內(nèi)使細(xì)胞滯留于某些檢查點(diǎn)，以使細(xì)胞在S期或有絲分裂之前修復(fù)受損DNA[13]。當(dāng)修復(fù)完成時(shí)，細(xì)胞可進(jìn)行到下一個(gè)細(xì)胞周期階段；若細(xì)胞無(wú)法完成修復(fù)，細(xì)胞周期可被永久阻斷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡[14]。然而當(dāng)細(xì)胞周期失調(diào)導(dǎo)致不受控制的細(xì)胞增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展最常見(jiàn)的原因[8]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，各HQ染毒劑量組G0/G1細(xì)胞比例下降，S期比例增加，即HQ使K562細(xì)胞阻滯于S期；與空白對(duì)照組比較，CDC25A、CyclinE在HQ染毒各劑量組表達(dá)量下降，且隨HQ濃度增加呈遞減趨勢(shì)，CyclinA、CDK2無(wú)顯著變化。研究發(fā)現(xiàn)Chk1/Chk2 -CDC25A -CyclinE/(A)/-CDK2通路參與由DNA損傷誘導(dǎo)的S期阻滯調(diào)控[15]，CyclinE-CDK2與CyclinA-CDK2復(fù)合物需要CDC25A激活[13]，CDC25A屬于磷酸酶CDC25家族成員，在細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)調(diào)控中有重要意義，是細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶CDK1上游的細(xì)胞周期正向調(diào)控因子。Tu等[16]利用HQ染毒肝細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CDC25A蛋白泛素化降解，同時(shí)檢測(cè)DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)的相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)ATM/ATR及磷酸化Chk2/Chk1的表達(dá)均上升，使細(xì)胞阻滯于S期。本研究結(jié)果提示HQ使參與S期進(jìn)程的CyclinE蛋白表達(dá)量下調(diào)，可能是HQ誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生S期阻滯的原因之一；此外，HQ染毒K562細(xì)胞使其DNA受損并且使CDC25A泛素化降解，因而推測(cè)HQ使K562細(xì)胞DNA損傷可能激活基因損傷修復(fù)ATM/ATR-Chk2/Chk1信號(hào)通路，導(dǎo)致CDC25A蛋白降解，最終使CyclinE-CDK2和CyclinA-CDK2復(fù)合物活化受抑，使細(xì)胞發(fā)生S期阻滯。

另外，DNA受損可激活A(yù)TM/ATR-Chk2/Chk1-p53-p21通路，使p21蛋白表達(dá)上調(diào)，p21蛋白作為周期負(fù)調(diào)控蛋白，是CDK抑制蛋白，因此p21上調(diào)可影響CyclinE-CDK2復(fù)活物活性，從而引發(fā)細(xì)胞周期阻滯，使受損DNA有充分時(shí)間得以修復(fù)[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)p53蛋白在低、中劑量組有一定程度增高，但p53蛋白下游p21蛋白表達(dá)并無(wú)上調(diào)，提示HQ染毒使K562細(xì)胞發(fā)生S期阻滯可能與p53-p21通路調(diào)控關(guān)系不大。此外，本研究發(fā)現(xiàn)PCNA在HQ染毒中、高劑量組表達(dá)量降低，PCNA是一類只存在于增殖細(xì)胞的階段性表達(dá)蛋白質(zhì)。有研究提示PCNA與S期 CyclinA-CDK2 復(fù)合物特異性結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程[17]。本研究中PCNA蛋白在HQ染毒中、高劑量組降低可能影響其與CyclinA-CDK2復(fù)合物的結(jié)合，從而影響S期的進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)[18]，用白藜蘆醇作用結(jié)腸癌細(xì)胞，使結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生S期阻滯，同時(shí)檢測(cè)PCNA蛋白發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量上調(diào)?？梢?jiàn)，不同細(xì)胞系在不同藥物作用下PCNA蛋白的表達(dá)并非相同。

綜上所述，HQ致K562細(xì)胞周期發(fā)生的S期阻滯可能與其下調(diào)CDC25A、CyclinE、PCNA蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究所用的紅白血病細(xì)胞K562具有紅系祖細(xì)胞特性，在某些誘導(dǎo)劑下能向紅細(xì)胞增殖分化[9]，因此本研究對(duì)闡明HQ引起的血液毒性有一定意義。K562細(xì)胞系又為具有高度增殖活性的腫瘤細(xì)胞，要探討HQ對(duì)正常造血系統(tǒng)細(xì)胞的影響，可利用動(dòng)物模型及非腫瘤細(xì)胞性的細(xì)胞進(jìn)一步研究，從而為HQ致造血損傷機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。