膿毒癥大鼠不同時點缺氧性肝損傷病理生理學特點及烏司他丁的保護作用

丁磊，龔一航，鄒寶嘉，劉夏磊，張百萌,李堅

(中山大學附屬第五醫院，廣東珠海519000)

膿毒癥是由各種感染引起的生理、病理和生化紊亂綜合征[1],常伴肝臟及其他靶器官損傷，低心排出量綜合征和感染性休克可能是引起缺血性肝炎(HH)的主要原因[2]。到目前為止，HH相關膿毒癥的機制未完全闡明，尚無標準、穩定的肝細胞缺氧動物模型以供研究。烏司他丁(UTI)作為常見的抑制急性炎癥藥物，已廣泛用于臨床，但很少有研究關注膿毒癥大鼠多時間點肝功能變化、病理生理學特征及UTI作用。2017年1～11月，本研究通過盲腸結扎穿刺(CLP)制備膿毒癥大鼠肝損傷模型，探討CLP后不同時期肝損傷和HH的病理生理特點，同時評估UTI在此過程中對大鼠的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 雄性SD大鼠175只，20～22周齡，體質量380～420 g，由中山大學動物實驗中心提供。記錄MAP的監護儀UT4000F prosystem購自美國Philips公司，血氣分析儀ABL 80 FLEX購自美國Radiometer公司，血氣分析試劑盒ABL 80 SC80購自美國Radiometer公司，TRIzol、Oligo(DT)購自日本Takara公司，逆轉錄儀器Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler購自美國Foster公司，cDNA引物由美國Invitrogen/Life Technologies公司設計，原代兔Hif-1α及小鼠β-actin購自美國ABclonal公司，抗小鼠IgG和抗兔IgG購自美國Cell Signaling Technology，全自動發光熒光系統購自中國Tanon公司，免疫組化試劑盒購自中國邁新公司，Hif-1α抗體購自中國Bioss公司，DAB購自美國Solarbio公司，測定ALT的試劑盒購自美國Cayman Chemical，測定AST的試劑盒購自美國BioVision公司，測定IL-6和TNF-α的試劑盒購自美國eBioscience公司，酶標儀iMark Microplate Reader購自美國Bio-Rad Laboratoriesm公司。

1.2 動物分組及模型制備 將175只SD大鼠隨機分為Sham組25只、Sham+UTI組25只、CLP組75只及CLP+UTI組50只，每組根據實驗持續時間(12、24、36、48和72 h)平均分為5個亞組，Sham組、Sham+UTI組各時間點5只大鼠，CLP組各時間點15只大鼠，CLP+UTI組各時間點10只大鼠。CLP組及CLP+UTI組參照文獻[3]方法進行CLP手術。腹腔注射戊巴比妥(60 mg/kg)麻醉，行左側股動脈置管，深度8 cm。動脈搏動穩定后，連接換能器記錄基線MAP，抽取血液0.2 mL進行動脈血氣分析。正中開腹暴露盲腸，擠壓盲腸以保證腸內容物分布均勻，4號絲線結扎約75%盲腸，18號針穿刺盲腸2次并擠出少量腸內容物。術中使用電熱毯和紅外線燈保持大鼠直腸溫度(36.5±0.5)℃。Sham組及Sham+UTI組僅行麻醉和開腹手術，并牽拉盲腸，但不進行盲腸結扎和穿孔術。所有實驗大鼠分層縫合關腹，并記錄實驗時間為T0，關腹后立即皮下注射溫生理鹽水(5 mL/kg)液體復蘇。Sham+UTI組及CLP+UTI組于T0時點腹腔內注射UTI 3 000 U/kg，后每12 h重復1次，直到實驗結束或大鼠死亡。大鼠復蘇返籠恢復進水，6 h后恢復進食。實驗過程中，175只大鼠參加試驗，死亡31只，其中CLP組死亡23只，CLP+UTI組死亡8只，共144只大鼠完成實驗。

1.3 膿毒癥一般情況評估、血氣分析及組織取材 術后分籠觀察大鼠，由2名研究者在各亞組時間點(12、24、36、48和72 h)用膿毒癥評分(MSS)[4]獨立評估，評估內容包括大鼠毛發、外觀、意識水平、活動程度、對刺激的反應、眼睛開合情況及呼吸狀況，對以上指標分別打分，分值越高說明大鼠總體狀況越差。研究者獨立評分后麻醉固定大鼠，體溫計插入大鼠直腸1 cm測量肛溫，右側股動脈置管測定大鼠血壓，原切口開腹，離斷肝圓韌帶及三角韌帶，暴露肝上下腔靜脈，取肝上下腔靜脈及股動脈導管(胸主動脈)血0.2 mL分別進行血氣分析，記錄動脈血pH、動脈氧分壓(PaO2)、靜脈氧分壓(PvO2)、動脈血乳酸(Lac),用PaO2-PvO2計算動靜脈分壓差(APDD)；開放動脈導管，留取大鼠動脈血約3 mL后予頸脫位法處死大鼠?？焖俳馄矢谓M織，部分標本固定于10%甲醛溶液中，4 ℃保存，部分標本置于凍存管，液氮保存。血液標本置于促凝管中，靜置2 h后在1 000 g環境下離心15 min，取上清液置于凍存管中，保存于液氮中。

1.4 血清學指標檢測 ELISA法檢測血清ALT、AST、IL-6和TNF-α。嚴格按試劑盒說明操作。

1.5 HE染色觀察 肝組織標本常規固定包埋切片，厚度10 μm。二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后，HE常規染色。顯微鏡下觀察標本細胞損傷程度并用器官損傷程度評分(ODS)表示[5]。

1.6 肝組織Hif-1α基因表達檢測 使用RT-PCR技術。TRIzol從大鼠肝組織中分離RNA，取RNA 1 μg逆轉錄為對應cDNA。Hif-1α正向引物為5′-CGGCGAGAACGAGAAGAAAA-3′，反向引物為5′-GGGGAAGTGGCAACTGATGA-3′。GAPDH作為cDNA內參，正向及反向引物分別為5′-CCTGGAGAACATGGCCAG-3′和5′-CCAGAGAGACACTGGTCC-3′，總反應體系為10 μL，包含50 ng cDNA，5 μL Sybr Green及混合引物1 μL。反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃2 min，共進行40輪PCR擴增，單個循環包括95 ℃ 15 s及60 ℃ 1 min。所有反應均在獨立反應管中進行，并重復3次取平均值，采用2-ΔΔCt法計算Hif-1α相對表達量。

1.7 肝組織Hif-1α蛋白表達檢測 采用Western blotting法。蛋白裂解液提取肝組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度，20 μg蛋電泳分離后轉移至PVDF膜。5%脫脂牛奶孵育1 h后，加入一抗：原代兔Hif-1α(5%胎牛血清稀釋，1∶2 000)及小鼠β-actin (5%胎牛血清稀釋，1∶2 000)，4 ℃過夜。5%TBST充分洗滌后，加入二抗：抗小鼠IgG和抗兔IgG(5%脫脂牛奶稀釋，1∶10 000)孵育1 h。在TBST中充分洗脫后，使用Tanon 5200 Multi system檢測條帶并使用Image J圖像分析軟件定量分析。

2 結果

2.1 各組大鼠不同時點直腸溫度、MAP、MSS評分比較 見表1。

2.2 各組血氣分析指標比較 見表2。

2.3 各組血清學檢測結果比較 見表3。

2.4 各組ODS評分、Hif-1α基因及蛋白表達比較 見表4。

3 討論

CLP模型目前是膿毒癥研究的金標準模型[6]，但其病理生理學變化機制尚未闡明。MSS評分可量化大鼠的一般情況，評估大鼠膿毒癥進展程度[4]。隨著CLP建模時間延長，大鼠MSS逐漸增加，一般狀況持續惡化。MAP和Lac水平是評價膿毒癥和膿毒癥休克的重要指標[7]。CLP后期(36 h后)，MAP和Lac變化明顯，其原因可能為膿毒癥休克早期心輸出量增加，后期血管阻力逐漸降低[8]。IL-6和TNF-α與炎癥及免疫反應相關，血清IL-6水平與感染性休克的嚴重程度相關。與Sham組相比，各時間段CLP組大鼠IL-6、TNF-α水平均明顯升高，其改變明顯早于大鼠生命體征開始變化的時間，提示細胞因子對膿毒癥的早期預警作用。

表1 各組大鼠不同時點直腸溫度、MAP、MSS評分比較

注：與Sham組相比,*P<0.05，**P<0.01；與CLP組相比，#P<0.05，##P<0.01。

細胞對缺氧環境的適應主要由缺氧誘導因子(HIF)來介導，在富氧環境下，Hif-1α發生羥基化。本研究中大鼠肝組織Hif-1α水平在基因及蛋白層面均隨實驗時間的延長而升高，在48、72 h達高峰，提示膿毒癥后大鼠組織缺氧。HE染色結果顯示，CLP大鼠隨實驗時間延長，組織損傷加重。目前很少有研究著重觀察CLP大鼠在多個連續時間點肝缺氧和膿毒癥間的聯系。Huang等[9]在不同時間點對CLP大鼠肝缺氧進行了研究，但僅使用了2個時間節點(9和18 h)。而引起CLP大鼠肝組織缺氧的原因可能包含大循環障礙和微循環障礙。本研究中，CLP晚期，尤其是48和72 h，大鼠PaO2明顯下降，提示組織氧供量絕對不足。APPD可描述氧氣的間接利用量，對比Sham組，APPD水平在CLP晚期顯著降低，提示氧轉運到肝細胞后不能有效利用。CLP后期大鼠PaO2和APPD顯著下降，提示全身嚴重缺氧和肝細胞氧攝取率下降可能是膿毒癥下肝缺氧性損傷的主要原因。

表2 各組血氣分析指標比較

注：與Sham組相比,*P<0.05，**P<0.01；與CLP組相比，#P<0.05，##P<0.01。

表3 各組大鼠血清AST、ALT、IL-6和TNF-α水平比較

注：與Sham組相比，*P<0.05，**P<0.01；與CLP組相比，#P<0.05，##P<0.01。

UTI是臨床上常用的急性炎癥反應抑制劑，本研究結果顯示，UTI對CLP大鼠具有一定保護作用，對比CLP組，CLP+UTI組大鼠血清炎癥因子(TNF-α、IL-6)在CLP后各個時段均明顯下降，大鼠的HE染色結果提示UTI對大鼠肝組織缺氧存在保護作用。其機制可能是UTI降低血炎癥因子水平，抑制淋巴細胞凋亡[10]，抑制超氧自由基生成和脂質過氧化反應，保護內皮細胞等[11]。對比CLP+UTI組和CLP組，僅72 h后CLP+UTI組PaO2和APPD顯著改善。UTI對于大鼠膿毒癥的進展并無逆轉作用，對大鼠宏觀生理指標的改善作用有限，并不會改善CLP大鼠轉氨酶水平。

表4 各組ODS評分及Hif-1α基因及蛋白表達比較

注：與Sham組相比，*P<0.05，**P<0.01；與CLP組相比，#P<0.05，##P<0.01。

HH是缺氧性肝損傷的重要形式。研究顯示[7]，HH患者血清轉氨酶水平會出現一過性升高(至少20倍)。本研究中我們發現，CLP大鼠只有72 h時AST水平升高，而其他時點CLP組轉氨酶水平無顯著變化。其他研究亦觀察到CLP大鼠AST升高，而ALT水平不變[12]的現象。本研究認為在轉氨酶升高之前，肝組織中已存在低氧。目前HH臨床診斷標準(轉氨酶升高至正常水平上限20倍以上等)[13]過于嚴格，不利于早期診斷。當轉氨酶水平顯著升高時，肝組織缺氧損傷已非常嚴重。本研究中，相比轉氨酶，PaO2和APPD變化在肝組織缺氧早期即有所體現，對于HH早期診斷可能有更重要的價值。

本研究中我們發現，可將CLP大鼠各項指標變化分為兩個階段，即早期CLP(12、24 h)和后期CLP (36、48、72 h)。前者大鼠各項指標平穩，存在組織缺氧但程度有限，后者大鼠生理指標迅速惡化，缺氧明顯加重。提示對于CLP誘導的膿毒癥大鼠，36 h可能對于炎癥爆發是一個重要的時間點，在此之前對炎癥進行干預可能至關重要[18]。

綜上所述，PaO2降低、肝細胞攝氧量下降可能是引起肝細胞損傷的主要原因。在CLP早期，肝細胞存在缺氧，缺氧的嚴重程度隨感染時間的延長而增加，但轉氨酶水平并未同時增加。在CLP晚期(72 h)時AST升高，而在整個研究過程中ALT水平無明顯變化。UTI對于膿毒癥引起的缺氧性肝損傷有一定保護作用，但不能徹底逆轉膿毒癥的進展。