冷凍禽畜肉類沙門氏菌快速分型檢驗中實時熒光PCR檢測技術的應用

李丹妮

目的：探討冷凍禽畜肉類沙門氏菌快速分型檢驗中實時熒光PCR（Quantitative Realtime PCR）檢測技術的應用價值。方法：抽取2018年3月- 2018年7月冷凍禽畜肉類樣品2000份，采取傳統(tǒng)標準方法與實時熒光PCR快速檢測技術進行檢驗，統(tǒng)計其檢驗結果。

結果：通過實時熒光PCR檢測顯示，本組樣品中檢出沙門氏菌76份（陽性率3.80%）明顯高于傳統(tǒng)標準方法38份（1.90%），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；進一步對檢出沙門氏菌血清分型鑒定顯示以海德堡血清型、肯塔基血清型、鼠傷寒血清型、腸炎血清型為主。

結論：實時熒光PCR檢測技術應用于冷凍禽畜肉類沙門氏菌快速分型檢驗中具有較好效果，有助于提升沙門氏菌檢出率，可快速分型，彌補了傳統(tǒng)標準檢驗耗時長、操作繁瑣等不足之處，具有更高臨床應用價值。

沙門氏菌（salmonella）是一種常見的食源性致病菌，廣泛分布于自然界內(nèi)，隨著現(xiàn)代臨床檢驗技術的不斷進步，臨床發(fā)現(xiàn)的沙門氏菌超過1000余種，對人類以及動物健康均可造成嚴重影響。沙門氏菌的傳統(tǒng)鑒定方法依據(jù)形態(tài)學特征、生理生化體征、培養(yǎng)特征、抗原特征、噬菌體特征等展開，不夠該檢驗鑒定程度相對復雜，耗時長，不利于推廣應用。熒光定量PCR（ realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR）是1996年由美國Applied Biosystems公司推出的一種新定量試驗技術，通過探針熒光染料或熒光標記的特異性，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應過程，結合相應的軟件可以對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。現(xiàn)有研究將該項技術引入冷凍禽畜肉類沙門氏菌快速分型檢驗中具有較好效果，鑒于此觀點，本文抽取2018年3月- 2018年7月冷凍禽畜肉類樣品2000份展開分析，評價實時熒光PCR檢驗技術的應用價值，現(xiàn)報道如下。

資料與方法

一般資料。抽取2018年3月～2018年7月冷凍禽畜肉類樣品2000份展開分析，其中冷凍禽類897份，冷凍畜類1103份。

方法。（1）試劑。選擇北京路橋公司提供的生化試劑以及泰國S&A;公司提供的分型鑒定血清、分離培養(yǎng)基、前增菌、后增菌。（2）儀器。采用全自動核酸提取工作站，以及南京貝登電子商務有限公司提供的實時熒光PCR儀、全自動微生物鑒定、藥敏分析儀。（3）檢測方法。檢測內(nèi)容均依據(jù)國家標準沙門氏菌檢驗方法展開增菌培養(yǎng)，隨后采用全自動核酸提取工作站進行核酸的提取工作（磁珠法），待細胞裂解后，將細胞中核酸分子吸附于磁性顆粒上，待其反應一定時間后，利用磁場作用將液體與磁性顆粒進行分離，回收顆粒（磁珠- DNA混合物），并進行脫洗。待各項程序完成后采取PCR檢測試劑盒展開實時熒光PCR反應檢測，檢驗沙門氏菌靈敏度與特異度。待檢驗完畢后對PCR檢測為陽性樣品者進行增殖液接種、培養(yǎng)；生化反應檢測通過挑取無色半透明H25菌株與可疑菌落，將其置放于營養(yǎng)瓊脂平板，在適量溫度環(huán)境內(nèi)（37℃）逐漸擴大培養(yǎng)，最后采用全自動微生物、藥敏反應進行鑒定與分析，各項操作均依據(jù)說明書完成。血清學分型鑒定中將生化鑒定檢驗陽性菌種，將其點種于瓊脂量低的瓊脂平板內(nèi)，在濕潤環(huán)境下誘導等操作內(nèi)容，隨后依據(jù)按照單因子血清、多價血清展開血清學實驗。

結果

通過實時熒光PCR檢測顯示，本組樣品中檢出沙門氏菌76份（陽性率3.80%）明顯高于傳統(tǒng)標準方法38份（1.90%），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；進一步對檢出沙門氏菌血清分型鑒定顯示以海德堡血清型、肯塔基血清型、鼠傷寒血清型、腸炎血清型為主。

討論

近年來我國正處于經(jīng)濟快速發(fā)展階段，隨著人們生活水平的改善，對于禽類、畜類等肉制品需求愈發(fā)增高。而與此同時冷凍禽畜肉類批次增多、數(shù)量增大，這便對多批次巨量冷凍禽畜肉類檢驗工作提出更高要求。若檢驗周期延長不僅可影響整個冷凍肉類供應的產(chǎn)業(yè)鏈及時性，同時對冷庫儲存、周轉等運作效率形成限制，增加了冷庫儲存周轉壓力。

沙氏門菌沙門氏菌病是指由各種類型沙門氏菌所引起的對人類、家畜以及野生禽獸不同形式的總稱。感染沙門氏菌的人或帶菌者的糞便污染食品，可使人發(fā)生食物中毒。據(jù)統(tǒng)計在世界各國的種類細菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首，我國內(nèi)陸地區(qū)也以沙門氏菌為首位，具有菌型多樣化、分布廣泛、檢驗復雜等特點。沙氏門菌的傳統(tǒng)檢驗主要包括分離培養(yǎng)、前后增菌的檢測、生化鑒定以及分型檢驗等程序，郭丹桂的研究中指出，傳統(tǒng)檢驗時間需要耗費4- 10d左右，由此可見其耗時表現(xiàn)費力，在現(xiàn)實工作中難以滿足需求。實時熒光PCR檢測技術主要利用DNA擴增反應，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法，在擴增期間，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關系，所以可成為定量的依據(jù)。在本次研究中通過實時熒光PCR檢測顯示，本組樣品中檢出沙門氏菌76份（陽性率3.80%）明顯高于傳統(tǒng)標準方法38份（1.90%），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；由此可見實時熒光PCR檢測技術確有較高檢出率。進一步分型可見顯示以海德堡血清型、肯塔基血清型、鼠傷寒血清型、腸炎血清型為主，這與趙建梅等人的研究結果表現(xiàn)一致性。

綜上所述，實時熒光PCR檢測技術應用于冷凍禽畜肉類沙門氏菌快速分型檢驗中具有較好效果，有助于提升沙門氏菌檢出率，可快速分型，彌補了傳統(tǒng)標準檢驗耗時長、操作繁瑣等不足之處，具有更高臨床應用價值。