一起蠟樣芽孢桿菌引起食物中毒的實驗室檢測

王偉棟 王麗娟 劉曉琳 王慧 曲劍英

蠟樣芽胞桿菌為條件致病菌，能產生耐熱和不耐熱兩種毒素，前者為致吐腸毒素，后者為致瀉腸毒素。該菌污染產毒的食品一般無腐敗變質的異味，不易被發覺，當食入食品含蠟樣芽胞桿菌達105cfu/g以上時，可引起食物中毒。2012年5月25日，青島某中學部分學生因食用學校食堂提供的午餐（盒飯），多名學生出現嘔吐、腹瀉、腹痛、發熱等癥狀，疑似食物中毒。流調人員采集了部分病人的嘔吐物、便樣和剩余食物，于21：30- 24：00將樣品帶回到實驗室進行檢驗。

流行病學調查

2012年5月25日中午，本市某中學學生食用學校食堂11：50開始分發的盒飯午餐，食物為米飯、紅燒茄子、烤雞塊、蝦皮蘿卜粉絲、熟玉米和小米稀飯等，13時起部分學生開始出現腹部不適，16時許部分學生陸續出現嘔吐、腹痛、惡心等癥狀，分別前往附近醫院就診。臨床癥狀以上腹部陣發性絞痛，最先出現的病例以嘔吐為主，嘔吐嚴重者12次/天，輕者1次/天，一般均在6～7次/天，后續病例以嘔吐加腹瀉，腹瀉一般1- 3次/天的急性胃腸炎癥狀為主，經對癥治療大部分患病學生于當日康復，無死亡病例。

實驗室檢測

試劑和材料。（1）培養基 本次檢驗所需的各種培養基和蠟樣芽胞桿菌成套生化鑒定管（SHBG09）由青島海博生物技術有限公司提供，均在有效使用期內。（2）熒光PCR試劑 蠟樣芽孢桿菌核酸測定試劑盒由上海之江生物科技股份有限公司提供，在有效使用期內。（3）儀器 MARK2 0805- 461智能厭氧培養系統、FIuoCycIe實時熒光定量PCR儀、TGL-16B高速臺式離心機、恒溫金屬浴等。

樣品采集。（1）食品樣品14份：留樣的盒飯一份（米飯、紅燒茄子、蝦皮蘿卜絲、烤雞腿快、蒸玉米棒）；李錦記草菇老抽1份、六合香無鹽味精1份、中鹽碘鹽1份、白梅砂糖1份、口福調和油1份、生茄子1份、生雞腿1份、生玉米1份、溫開飲用水1份。（2）患者嘔吐物13份（樣品標記6#—18#）；（3）患者便樣5份（樣品標記1#—5#）。（4）餐具無菌生理鹽水棉拭子8份。以上樣品均為無菌采樣，送實驗室檢驗。

檢驗項目。根據流行病學調查要求檢測：蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌、變形桿菌、志賀氏菌、致病性大腸埃希菌、副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌；溫開飲用水加做菌落總數和總大腸菌群；餐具僅檢測大腸菌群。

檢驗方法。參照國家標準W S /T 82-1996、WS/T13- 1996、WS/T9- 1996和GB/ T4789.5，6，7，GB4789.10- 2003、GB/T 5750.12- 2006、GB14934- 1994。

檢驗程序。（1）嘔吐物、便樣檢測：①直接分離：接種MYP平板、沙門氏菌顯色平板、XLD平板、EMB平板、弧菌顯色平板、B- P平板和營養瓊脂平板36℃培養24h。②增菌分離：分別放入10ml的肉浸液肉湯、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液、GN增菌液、3%堿性蛋白胨水和7.5%NaCl肉湯增菌液中。37℃培養18小時，志賀氏菌增菌肉湯41.5℃厭氧培養18小時。經培養后分離到相應選擇分離平板，37℃培養20小時，挑取可疑菌落進行鑒定。（2）食品和溫開飲用水檢測：按照食品安全國家標準、食品衛生微生物學檢驗和GB/T5750.12-2006生活飲用水標準檢驗方法微生物指標進行相應檢測。（3）餐具大腸菌群采用發酵法檢測。（4）熒光PCR試劑盒按說明書使用。蠟樣芽孢桿菌嘔吐毒素基因cesB為檢測靶標的，結果僅供參考。

結果。（1）食品樣品14份經增菌液，分離的選擇平板上均未見可疑菌落生長，所檢項目均為未檢出。（2）患者嘔吐物13份增菌液和直接分離選擇平板僅9#和14#見蠟樣芽胞桿菌可疑菌落生長，涂片鏡檢為G+大桿菌，芽胞呈卵圓形，不突出菌體，位于菌體的中央或稍偏一端。經生化鑒定為蠟樣芽胞桿菌，生化分型為5型（詳細結果見表）。嘔吐毒素基因2株均為陽性。其余選擇平板上均未見可疑菌落生長，所檢項目均為未檢出。（3）便樣5份增菌液和直接分離平板，均檢出大腸埃希菌，經鑒定均為非致病性大腸埃希菌，其余選擇平板可疑菌落均未見生長，所檢項目均為未檢出。（4）溫開飲用水 菌落總數3800CFU/mL和總大腸菌群<2MPN/100mL。（5）餐具樣品 大腸菌群均為陽性結果。

討論

1.我國引發蠟樣芽胞桿菌食物中毒的食品多為食用了加熱不徹底或保存不當的剩米飯所致，在發生本菌食物中毒時，中毒食品大多無腐敗變質現象，除米飯有時微有發粘、人口不爽或稍帶異味外，大多數食品的感官性狀正常。引起本次食物中毒食品25日中午食堂工作人員使用3板24日中午的剩余米飯，剩余米飯存放于打開門的蒸箱內，未冷藏保存，剩余米飯在室溫自然條件下存放超過18h，為蠟樣芽胞桿菌的繁殖提供了條件。

2.食物中毒檢測的采樣是關鍵，影響細菌性食物中毒檢驗結果因素有盲目性、缺乏及時性、代表性、典型性、完整性等。5月25日13：30時個別學生開始出現腹部不適，在16：00時部分學生陸續出現發病癥狀并前往醫院就診，而且在發病學生持續增加的情況下，直至當晚18：00才報告情況，導致事故處置遲緩滯后，食物中毒采集到病人嘔吐物和便樣缺乏及時性和代表性。由于導致食物中毒的盒飯通過分餐、裝箱、運轉、傳送、分發及學生領取餐盒的過程很隨機，無法定位盛有剩米飯的餐盒發給那一部分學生。

3.腸毒素檢測。蠟樣芽胞桿菌生化性狀與蘇云金芽孢桿菌極為相似，雖可藉蘇云金芽孢桿菌細胞內產生蛋白質毒素結晶加以鑒定，但試驗所需時間較長。本次利用熒光PCR法檢測蠟樣芽孢桿菌嘔吐毒素基因cesB，檢查分離菌株的產毒性來協助診斷，結果比較理想。目前利用蠟樣芽孢桿菌毒素基因進行快速的實驗室檢測方法較多，由于受所用儀器、試劑及毒素基因的性質影響，建立一種簡便可靠的檢測方法作為快速診斷手段，仍待研究解決。