線粒體鈣單向轉運體在β淀粉樣蛋白誘導小膠質細胞凋亡中的作用機制

謝南昌,余夢嫣,王 翠,李英嬌,孟祥荷,連亞軍

阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種進展性中樞神經系統退行性疾病,以記憶力下降、認知功能障礙為主要臨床特征[1]。細胞外β淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)沉積形成神經炎性斑(neuritic plaques,NP)是AD主要病理特點,指Aβ沉積周圍出現大量反應性小膠質細胞。生理狀態下,小膠質細胞處于靜止期,在AD等神經退行性疾病中,小膠質細胞發生活化并吞噬清除β-淀粉樣蛋白,但過度活化或凋亡導致促炎性細胞因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α、NO等)釋放,從而導致神經毒性或一系列不可控炎癥反應[2]。因此在AD治療靶向目標上,越來越多的目光移向小膠質細胞。

研究證明[3,4]活化的小膠質細胞發揮吞噬作用或促炎癥因子的釋放等功能均是鈣離子依賴性的。最近鑒定出的鈣離子單向轉運體(mitochondrial calcium uniporter,MCU)是一種位于線粒體內膜上介導鈣離子內流的選擇性鈣通道,在細胞和線粒體鈣離子濃度調節過程中發揮重要作用[5]。以往研究[6,7]證實ER-線粒體串話參與Aβ誘導的神經元凋亡,且線粒體功能損傷增強了Aβ誘導的內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。ERS時內質網分子伴侶葡萄糖調節蛋白質(glucose regulating protein 78,GRP78)首先與3種跨膜蛋白解離而被激活,啟動ERS生存途徑。ERS過度時,則啟動ERS凋亡途徑,相關凋亡分子CHOP(C/EBP homologous protein,CHOP)和caspase-12上調表達。最近研究[8,9]發現MCU在心肌損傷及腦缺血再灌注損傷中發揮重要作用,但MCU在Aβ誘導小膠質細胞凋亡中的作用仍未闡明。

本研究中,我們采用MCU抑制劑Ru360[10]和激動劑Spermine[11]來研究MCU在Aβ誘導體外原代培養小膠質細胞凋亡中的作用及機制。并進一步采用線粒體特異性抗氧化劑MitoQ來明確線粒體氧化應激與ERS之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM 培養基、FBS(購自美國Hyclone公司)；Ru360(購自美國Millipore 公司)；Spermine、Aβ25-35(購自美國 Sigma 公司)；MitoQ(購自新西蘭MedChemExpress公司)；Rhod-2/AM(購自美國Life Technologies公司)；蓖麻凝集素-1(ricinus commol/Lunis agglutinin-1,RCA-1)抗體(購自美國 Vector 公司)；MitoSOX 熒光探針(購自美國Invitrogen公司)；GRP78、CHOP、caspase-12抗體(購自美國CST公司)；β-actin(購自武漢三鷹公司)；Annexin V-FITC/PI 雙染凋亡檢測試劑盒、全蛋白提取試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 原代小膠質細胞的制備與分組 取BALB/C新生小鼠(購自河南省動物實驗中心),無菌條件下分離出雙側大腦皮質,剪成小塊,用0.125%胰蛋白酶溶液在37 ℃恒溫水浴消化20 min后加入培養液以終止消化。用滴管反復吹打成細胞懸液,200目尼龍網過濾,過濾液以1000 r/min離心,棄上清,加入培養液重懸。然后接種于培養瓶中培養至第10～14天時,用搖床固定以180 rpm震蕩2 h,將振搖下來的小膠質細胞接種于培養瓶中培養。小膠質細胞純度通過RCA-1染色驗證>95%。將純化的小膠質細胞隨機分為5組,分別是對照組、Aβ25-35組、Ru360組、Spermine組、MitoQ組。對照組未特殊處理。Aβ25-35組用20 μmol/L Aβ25-35處理小膠質細胞24 h。Ru360組和Spermine組分別用5 μmol/L Ru360和10 μmol/L Spermine預處理原代小膠質細胞1 h,然后二者均用20 μmol/L Aβ25-35處理24 h。MitoQ組先用0.1 μmol/L MitoQ處理6 h,再20 μmol/L Aβ25-35處理24 h。實驗程序經鄭州大學委員會批準,動物實驗操作規范嚴格參照國際標準。

1.2.2 Aβ25-35聚合物的制備 使用HFIP溶解至1 mmol/L,在生物安全柜中蒸發去除HFIP形成肽膜。-80 ℃保存。使用時將肽膜溶于無水DMSO中至5 mmol/L(儲備溶液)。使用時用冷PBS將溶液稀釋至100 μmol/L,4 ℃孵育24 h,并在4 ℃以14,000 g離心10 min,將含有可溶性Aβ25-35寡聚體的上清液轉移至干凈的試管中4 ℃保存備用。

1.2.3 線粒體鈣離子濃度測定 首先用HEPES 緩沖液沖洗原代小膠質細胞,然后用含有11 μmol/L鈣離子熒光探針Rhod-2/AM的HEPES緩沖液在低溫下孵育15 min。使用分光光度計在575 nm的激發波長和605 nm的發射波長下測量熒光。

1.2.4 流式細胞術檢測 先收集細胞并用冰冷的PBS洗滌兩次,于200 μl結合緩沖液懸浮培養。 細胞重懸后,每個樣品中各加入5 μl 膜聯蛋白V-FITC和5 μl碘化丙錠。然后在室溫下在黑暗中孵育10 min。在FACScan流式細胞儀上進行檢測分析。

1.2.5 線粒體ROS生成水平檢測 使用線粒體熒光探針MitoSOX評估線粒體ROS生成水平。用5 μmol/L MitoSOX工作液37 ℃避光孵育胰蛋白酶已處理過的原代小膠質細胞15 min,PBS清洗,然后通過流式細胞術分析ROS生成水平,結果以各單位的熒光強度表示。

1.2.6 Western blotting分析 通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離30 μg蛋白質,然后轉移到PVDF膜上。室溫下膜在5%脫脂奶粉組成的封閉溶液中封閉2 h。 然后用一抗GRP78(1∶1000)、CHOP(1∶1000)和caspase-12(1∶1000)抗體在4 ℃過夜孵育膜,內參為β-actin蛋白,用抗β-actin抗體(1∶2000)檢測)。1×TBST溶液清洗3次,每次10 min。二抗中室溫下孵育1 h,再1×TBST溶液清洗3次,每次10 min。用ECL化學發光液曝光,使用分光密度計的光密度分析來量化條帶強度。

2 結 果

2.1 MCU對Aβ25-35誘導原代小膠質細胞凋亡的作用 通過流式細胞術檢測凋亡細胞發現,和對照組相比,Aβ25-35組細胞凋亡明顯增多(P<0.05)；與Aβ25-35組相比,Ru360組小膠質細胞凋亡明顯減少,而Spermine組小膠質細胞凋亡明顯增多(P<0.05)(見圖1)。

2.2 MCU對線粒體鈣離子濃度和線粒體ROS生成水平的作用 與對照組相比,Aβ25-35組原代小膠質細胞線粒體鈣離子濃度和線粒體ROS生成水平明顯增加升高(P<0.05)；與Aβ25-35組相比,Ru360組線粒體鈣離子濃度和線粒體ROS生成水平明顯降低,而Spermine組線粒體鈣離子濃度和線粒體ROS生成水平明顯升高(P<0.05)(見圖2)。

2.3 MCU對GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表達影響

2.4 MitoQ對ERS的激活作用 與對照組相比,Aβ25-35組原代小膠質細胞GRP78、CHOP和caspase-12的表達水平明顯增加(P<0.05)；與Aβ25-35組相比,Ru360減少了GRP78、CHOP和caspase-12表達水平的升高,而Spermine增加了GRP78、CHOP和caspase-12表達水平的升高(P<0.05)(見圖3)。與Aβ25-35組相比,MitoQ明顯降低了線粒體ROS生成水平,并且MitoQ預處理可降低GRP78、CHOP和caspase-12表達(見圖4)。

與對照組比較*P<0.05；與Aβ25-35組比較#P<0.05(各組實驗重復5次)

圖1 流式細胞術檢測正常對照組、Aβ25-35組、Aβ25-35+Ru360組、Aβ25-35+Spermine組細胞凋亡

A：與對照組比較*P<0.05；與Aβ25-35組比較#P<0.05。B:與對照組比較*P<0.05；與Aβ25-35組比較#P<0.05(各組實驗重復5次)

圖2 A:Ru360和Spermine對Aβ25-35誘導的小膠質細胞線粒體鈣離子濃度的影響;B:Ru360和Spermine對Aβ25-35誘導的小膠質細胞線粒體ROS生成的影響

與對照組比較*P<0.05；與Aβ25-35組比較#P<0.05 (各組實驗重復5次)

圖3 Ru360和Spermine對Aβ25-35誘導的小膠質細胞內質網應激通路蛋白CHOP、GRP78、caspase-12表達的影響

A：與對照組比較*P<0.05；與Aβ25-35 組比較#P<0.05。B：與對照組比較*P<0.05；與Aβ25-35組比較#P<0.05(各組實驗重復5次)

圖4 A:MitoQ對Aβ25-35誘導小膠質細胞線粒體ROS生成水平的影響;B:MitoQ對Aβ25-35誘導小膠質細胞內質網應激通路蛋白CHOP、GRP78和caspase-12表達的影響

3 討 論

本研究中,我們證實了MCU在Aβ25-35誘導小膠質細胞凋亡中發揮重要作用,發現抑制MCU可通過緩解線粒體鈣超載、氧化應激及ERS對Aβ25-35誘導小膠質細胞凋亡發揮神經保護作用,而激活MCU發揮相反作用。且進一步發現采用線粒體特異性抗氧化劑MitoQ干預緩解了ERS,表明線粒體氧化應激介導了Aβ25-35誘導小膠質細胞ERS的激活。

MCU是鈣離子進入線粒體的重要通道,當線粒體與內質網之間形成瞬間高濃度Ca2+微區[12]或結合激動劑Spermine時,MCU開放從而導致線粒體鈣離子濃度升高。生理狀態下,線粒體基質可代償增多的鈣離子,但線粒體鈣超載會導致線粒體通透性轉運孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)開放,并可刺激ROS生成,引起線粒體膜電位降低,細胞色素C釋放,導致細胞凋亡。氧化應激是神經退行性疾病如AD的發病機制之一[13,14],其在Aβ介導的神經毒性過程中起著重要作用[15]。本研究發現Aβ25-35誘導的小膠質細胞線粒體Ca2+濃度和ROS生成水平升高,而MCU抑制劑逆轉了線粒體鈣超載和氧化應激。以往研究發現Spermine可增強缺血再灌注引起的氧化應激,并且MCU抑制劑可降低因腦和心臟細胞中的鐵超載引起的ROS產生[16～19],這些發現與本研究結果一致。

ERS時,GRP78表達上調促進蛋白正確折疊、協助錯誤折疊蛋白的轉移以恢復ER穩態,但過度或持續的ERS可激活CHOP、caspase-12和JNK通路誘導細胞程序性死亡。CHOP可通過上調促凋亡基因Bax/Bak、下調抗凋亡基因Bcl-2促進細胞凋亡[20],而caspase-12活化后激活caspase-9、caspase-3從而導致細胞凋亡。以往研究[6,7]證實線粒體-ER串話參與Aβ誘導的神經元凋亡,本研究發現Aβ25-35誘導小膠質細胞內質網應激相關蛋白GRP78、CHOP和caspase-12表達增加,提示Aβ25-35激活小膠質細胞內質網應激反應。我們進一步發現MCU抑制劑顯著降低GRP78、CHOP和caspase-12表達并減少小膠質細胞凋亡,而Spermine增加GRP78、CHOP和caspase-12表達并增加小膠質細胞凋亡,表明MCU調控的ERS在Aβ誘導的小膠質細胞凋亡中發揮重要作用。

許多病理狀態下,氧化應激與內質網應激密切相關,氧化應激可以破壞ER功能,并誘發內質網應激[21,22]。MitoQ是目前線粒體靶向抗氧化劑中最具代表性的。本研究發現MitoQ抑制了Aβ25-35誘導小膠質細胞線粒體ROS產生的同時并降低GRP78、CHOP和caspase-12表達,因此提示線粒體ROS介導的ERS在Aβ25-35誘導小膠質細胞凋亡中發揮作用,與以往研究氧化還原信號傳導途徑支配ERS相一致[23,24]。

綜上所述,抑制MCU對Aβ誘導的小膠質細胞凋亡發揮神經保護作用,且氧化應激介導的ERS可能在MCU參與Aβ25-35誘導的小膠質細胞凋亡中發揮重要作用。