小型豬不停跳冠脈旁路移植模型建立初探

王 鑫 黃墨林 張 銳 偉 俊 鄭遠彪 葛建軍

冠狀動脈旁路移植術（CABG）作為冠狀動脈粥樣硬化型心臟病（CHD）治療的主要方法，由于取材的限制，通常選用大隱靜脈作為橋血管的主要血管，因此使得內膜增生成為了靜脈移植后通暢的主要障礙，雖然血管平滑肌細胞的遷移和增殖樞轉會影響血管重塑過程，但尚未有系統預防靜脈移植物內膜增生的治療方法[1]。縱觀當前國內外研究，多通過建立大鼠[2]、家兔[3]、狗[4]的頸靜脈移植模型及小型豬的大隱靜脈-頸內動脈模型[5～6]來尋找靜脈移植物內膜增生的系統療法，缺乏對完全模擬人類心臟不停跳冠脈搭橋手術動物模型構建的研究。眾所周知，臨床實踐中，冠脈較頸動脈的分支更多，血流情況相對更復雜，冠脈旁路移植手術的難度也更大，單純的頸靜脈移植物內膜增生情況缺乏一定的代表性，因此，有針對性的模擬人類不停跳冠脈搭橋手術建立動物模型是十分有必要的。通過文獻研究發現，豬的冠脈解剖更接近于人[7]。故本文創新性的選擇小型巴馬豬建立不停跳冠脈旁路移植模型，結合實踐過程理清實驗的思路、方法、遇到的問題及解決辦法，總結經驗，完成構建小型巴馬豬建立不停跳冠脈旁路移植模型的初探，為建立成熟穩定的小型豬冠脈搭橋模型奠定理論及實踐基礎。同時也對CABG術后橋血管的再狹窄的研究及年輕臨床醫生練習不停跳冠狀動脈旁路移植術產生一定的指導意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 經安徽醫科大學動物實驗倫理委員會批準后，采用簡單隨機抽樣法從泰州小型豬生產基地選取30頭健康小型巴馬豬，雌雄不分，體重35～40 kg，術前正常喂養1周。

1.2 實驗器械及藥品 器械主要包含動物呼吸機1臺，心電監護儀1臺，電刀1臺，負壓吸引器1臺，除顫儀1臺，搭橋器械1套，組織剪、組織鑷、止血鉗、蚊氏鉗若干，6/0及7/0 prolene線，普通絲線，氣管插管、心表固定器，吹管等。藥品主要包含舒泰（替來拉明+唑拉西泮）、鹽酸賽拉嗪等。

1.3 實驗過程

1.3.1 實驗前準備 正常喂養1周，術前禁食12 h，禁水4 h，稱重，準備手術臺，準備多巴胺、利多卡因、阿托品等搶救藥品。

1.3.2 麻醉 給予舒泰2.5 mg/kg，鹽酸賽拉嗪2 mg/kg進行肌注麻醉。麻醉后給予手術區域備皮，固定后于耳緣靜脈建立靜脈通道，氣管插管并連接呼吸機，參數：吸入氧濃度（FiO2）60%，通氣頻率（f）20次/分，潮氣量8～10 mL/kg。并于后腿第二關節內側切開行股動脈穿刺，檢測動脈血壓及血氧飽和度。

1.3.3 手術過程 ①手術區域消毒后于后腿關節外側切開，采用“NO-TOUCH”技術分離大隱靜脈，用0號或1號線結扎分支，離取約8～10 cm血管，用肝素水沖洗管腔后備用。②胸骨正中切開，分離組織后用胸骨劈刀劈開胸骨，分離組織并暴露心臟及主動脈，靜推2 mg/kg肝素，于主動脈上選取合適位置縫合主動脈-大隱靜脈，待心率血壓穩定后，分離前降支，于合適位置縫合大隱靜脈-前降支。止血，關胸，鋼絲固定胸骨，縫皮。

1.3.4 術中管理 術中每小時追加一次舒泰（劑量為初始劑量的1/3）及肝素（劑量為初始劑量的1/2），持續泵入丙泊酚6～8 mL/h維持麻醉；同時加以青霉素10萬單位/公斤靜滴預防感染，500 mL生理鹽水加入1 g氯化鉀及1.25 g硫酸鎂補充液體和電解質。

1.3.5 術后管理 術后單籠喂養觀察，持續靜脈補液，每天分兩次靜脈給予青霉素（10萬單位/公斤），待3天后恢復自主進食，精神良好后可返回普通飼養籠。

1.3.6 靜脈獲取 術后4周麻醉，開胸（操作同前），分離黏連組織后取出橋血管，觀察通暢情況。實驗豬可通過心房注射KCL處死。

2 研究結果

本實驗共選取30頭巴馬小型豬進行手術，因技術操作失誤、術前準備不當、溫度失衡等原因死亡8頭，失敗2頭（見表1），成功20頭。實驗后期，經觀察發現，術中實驗豬血壓心率穩定，橋血管充盈，血流豐富（見圖1），4周后取出大隱靜脈橋血管，肉眼可見橋血管通暢，血管與周圍組織黏連（見圖2、圖3），HE染色光鏡下見橋血管內膜中膜有明顯增厚，細胞排列不規則（見圖4）。

表1 實現過程中不良事件及出現原因剖析

3 討 論

3.1 實驗動物的選取 通過文獻研究及實驗發現，豬類冠狀動脈與人類冠狀動脈的相似度較高。同時飼養簡單，抗感染能力強，較為適宜進行動物實驗研究。本實驗在研究初期，曾選擇普通肉用豬作為實驗用豬，在實驗使用3頭豬后，發現普通肉用豬生長速度較快，短期內體重變化較大，不易控制且個體差異較大，遺傳因素不穩定，術中耐受程度較低，麻醉和血管吻合過程中易發生窒息和室顫，考慮到此些因素易使研究結果產生偏倚，經實驗總結、專題小組討論、文獻資料研究后我們更換實驗用豬為巴馬小型豬，更換實驗動物后我們發現，實驗情況得到了很大程度的改善。巴馬小型豬為何更適宜作為實驗用豬，通過實驗總結我們發現，其具備以下幾點優勢：①巴馬小型豬遺傳因素穩定，一致性較好，其在我國作為實驗用豬，已近親培育20余年，廣西巴馬小型豬在21個微衛星位點的平均基因純合率為55.5%，表明其近交程度高，平均PIC和平均雜合程度均較低，實驗研究時組間差異較小，非常適合作為實驗用豬。②巴馬小型豬的生長速度較慢，成年豬體重為35～40 kg，短期內體重不會發生較大變化[8]，能夠保證實驗過程樣本的穩定性，利于實驗的持續監測。③巴馬小型豬的耐受程度高，術中對缺血缺氧的耐受程度明顯高于普通肉用豬，利于實驗的開展。④巴馬小型豬生理生化指標相較于普通家豬和人類更為近似，其共有14項血液生理指標及18項血液生化指標和人類相似，更適合作為心血管系統研究的實驗用豬[9]。但值得注意的是，小型巴馬豬的生理結構和人不同，大隱靜脈位于后腿外側，因此可從一側后腿第二關節取至根部，長度達10～15 cm即可。

3.2 實驗難點及解決策略 巴馬小型豬豬皮較厚，后肢粗短，股動脈較難觸及，這就造成了我們在實驗過程中遇到穿刺困難的難題，這很不利于我們在搭橋手術中對巴馬小型豬的動脈血壓進行持續動態監測，如果該問題得不到解決也將嚴重阻礙實驗的進行。在多次嘗試后，我們采取切開穿刺方法，后用帶線縫合針固定，取得了較好效果，使得實驗得以順利開展。在器械的選擇上，由于豬喉和豬口腔的特殊解剖關系，無豬類專用器械可用，實驗初期插管較為困難，后經總結經驗及多次練習后，我們應用成人大號彎喉鏡沿嘴角進入，縮短距離，并以止血鉗牽舌，協助暴露，但由于巴馬豬的耳緣靜脈較細，如果靜脈留置針18G、20G、22G（國際型號）過粗則植入較為困難，靜脈留置針26G（國際型號）過細則容易堵塞，均達不到補液要求，經換用不同型號的留置針后，最后發現24G（0.7 mm×19 mm，國際型號）型號留置針最為合適。如術中失血較多，可雙側耳緣靜脈建立靜脈通道，多通道同時補液。

與人類相比，巴馬小型豬血液易凝，黏滯度較高，部分凝血活酶時間（APTT）為23.73 s（人類為30～45 s）,凝結酶凝結時間（TT）為13.66 s（人類為16～18 s）[10]，所以當動脈穿刺成功后應立即予以肝素水沖洗。同理，在開胸后立即予以肝素2.0～2.5 mg/kg靜推，測ACT約300 s左右，并每隔1 h給予肝素，劑量為首次劑量的一半，以防止術中出現血栓，誘發心梗而除顫成功率較低的情況；小型巴馬豬相較于人類具有更短的左冠狀動脈和側支，即使是回旋支動脈也無法到達后室間溝[11]，至少90%的室間靜脈流出物源自左前降支冠狀動脈灌注的心肌的血液[12]。所以在吻合前降支時，如果缺血時間過長，很容易誘發心梗及室性心律失常，故吻合時如果發生心率大于160次/分或小于60次/分、血壓波動明顯、氧飽和度下降等情況，應立即靜脈給予利多卡因（1～2 mg/kg），同時取利多卡因少量于心臟表面浸潤，預防室顫發生。選擇吻合口應盡量選擇前降支末端，減少吻合時的缺血范圍。若發生室顫，應立即給予5～10焦耳心表電除顫。

3.3 實驗過程的糾偏 實驗初期，我們僅對實驗豬進行冠狀動脈旁路移植術，對原正常冠脈不作處理，4周后取出橋血管，血管閉塞，內皮增生嚴重，血管狹窄，無血流通過（見圖5），考慮如此短時間內導致的血管閉塞，可能是由于原冠狀動脈無病變，導致橋血管血流不足引起的橋血管閉塞[7]。后我們采取絲線7號線完全結扎原冠脈，模擬冠心病冠脈情況，人工造成狹窄以增加橋血管血流量，4周后取出橋血管，發現情況得到明顯改善，血管內膜增生情況較前有明顯減輕（見圖6），血流通暢，心臟跳動情況正常。但在橋血管建立后，結扎原冠脈時，心臟易發生心梗、室顫及室性心率失常，應特別注意。可能是由于缺血過程過快，心臟無法代償所致。故可緩慢結扎前降支，增加心臟適應過程。

3.4 混雜因素的消除 心電圖示波的時候，豬毛會阻礙電極片與皮膚的接觸，影響示波，即使刮去豬毛，豬皮上的小絨毛也會使電極片接觸不穩定，手術時間較長的情況下依舊容易脫落，因此后來我們采取電極片和縫合針直接連接，并將縫合針直接縫在四肢上，更加簡單、有效。

巴馬小型豬因術中失血、大量補充液體、開胸暴露心臟等原因使得心臟溫度下降過快，冬季情況更為明顯。如果因此導致室顫發生，在沒有復溫、保溫設備的情況下，則復跳困難。故我們采取提高室內溫度（25 ℃左右）、無菌鋪單下鋪設電熱毯、術中補充加溫液體等措施，取得了較好效果。部分實驗巴馬豬由于術后疼痛會出現煩躁、不進食、剮蹭靜脈留置針和引流管等情況，如不及時處理，將導致術后無法補液、補充能量和使用抗生素，進而致使實驗動物死亡。我們采取舒芬太尼5～10 μg加入500 mL生理鹽水中靜滴，青霉素5萬單位/公斤，1日兩次，在未進食情況下，每日需補液2000 mL/天。如煩躁情況較嚴重，可換至小籠（不影響呼吸）制動，固定四肢，可有效防止靜脈留置針及引流管的脫落，還可減少傷口的撕裂和感染。待情況穩定，開始進食（一般2～3天）后換至普通籠中飼養。

4 研究展望

實驗初期手術操作及實驗人員之間的配合不夠熟練，導致吻合遠端血管的時間過長，增大了實驗難度，同時由于初期探索階段對混雜因素把握的不夠全面，導致了部分實驗巴馬豬的死亡。除去這些導致巴馬豬死亡原因，我們發現小型豬的不停跳旁路移植模型的建立是可行的。故在后期，我們在積累經驗的基礎上，亟需通過本文總結的經驗加以優化，嚴格控制混雜因素，選取擁有較多的臨床經驗的實驗人員，逐步減少術后不良事件的發生，增加該實驗的穩定性。