氣相色譜-靜電場軌道阱高分辨質譜法測定水中16種痕量亞硝胺

李美萍 李蓉 王志娟 張慶 白樺 張生萬 呂慶

摘?要?建立了固相萃取-氣相色譜-靜電場軌道阱高分辨質譜檢測飲用水中16種痕量亞硝胺的方法。水樣經固相萃取富集、氮吹定量濃縮后，用DB-35MS色譜柱分離，高分辨質譜全掃描模式檢測，內標法定量。對色譜分離條件、質譜離子源溫度、色譜載氣流速、進樣方式以及脈沖壓力等參數進行優化，得到最優條件為離子源溫度280℃、載氣流速2.0 mL/min、脈沖不分流且脈沖壓力為200 kPa。通過四因素三水平正交實驗得到最佳的固相萃取條件為Chromabond HR-P萃取柱、10 mL乙酸乙酯洗脫。結果表明，本方法對于不同亞硝胺的線性范圍為0.2～500 μg/L，相關系數（R2）為0.9943～0.9997，檢出限（LOD）為0.05～0.5 ng/L，定量限（LOQ）為0.1～1.0 ng/L，遠低于目前各國的限量水平。4個不同水平的加標回收率為72.4%～114.8%，相對標準偏差（RSD，n=6）為0.8%～9.5%。采用本方法對北京地區的12個實際水樣進行測定，有5種亞硝胺被檢出，含量為0.9～20.4 ng/L。本方法靈敏度和準確度高， 選擇性好， 適用于水中痕量亞硝胺的檢測。

關鍵詞?亞硝胺; 固相萃取; 氣相色譜; 高分辨質譜; 飲用水

1?引 言

亞硝胺是一類具有NNO結構的污染物，迄今為止已發現的300多種亞硝胺中約有90%具有致癌作用[1]。近年來，在啤酒、熏肉制品、化妝品、煙草和乳膠制品中均檢出亞硝胺，在河水、地下水、污水和飲用水[2，3]中均發現了亞硝胺的存在。 研究表明，包括二氧化氯、臭氧及氯在內的消毒過程，結合紫外線等， 可能導致亞硝胺含量增加[4]。飲用水中亞硝胺的安全問題逐漸受到重視，國際癌癥研究署（IARC）將N-亞硝基二甲胺（NDMA）和N-亞硝基二乙胺（NDEA）列為2A 類致癌物，將N-亞硝基二丙胺（NDPA）、N-亞硝基甲基乙基胺（NMEA）、N-亞硝基嗎啉（NMOR）、N-亞硝基吡咯（NPYR）、N-亞硝基哌啶（NPIP）和N-亞硝基二丁胺（NDBA）列為2B類致癌物[5]。美國環境保護署（EPA）規定， NDEA、NDMA、NDBA和NPYR水體中的最高容許濃度（致癌風險達到10-5時）分別為2、7、60和200 ng/L[6]; 加利福尼亞州規定飲用水中NDMA、NDEA和NDPA的限量為10 ng/L[7]; 德國規定NDMA和NMOR的最大殘留限量為10 ng/L[8]; 加拿大國家標準中規定NDMA限值為40 ng/L。我國也亟待出臺飲用水中亞硝胺的限量標準。

由于水中亞硝胺的限量和含量極低，因此預富集濃縮的前處理步驟必不可少。已報道的液液萃取（LLE）[9]、固相萃取（SPE）[10]、固相微萃取（SPME）[11]等前處理技術中，SPE可對大體積水樣進行萃取，具有重現性好、濃縮倍數高等特點，適用于各種類型水體中亞硝胺的萃取，還可根據水樣類型選擇合適的填料，是水中亞硝胺萃取的主要方法。目前，水中亞硝胺的檢測方法有液相色譜（HPLC）[12]、液相色譜-質譜（HPLC-MS）[3]、氣相色譜（GC）[13]和氣相色譜-質譜（GC-MS）[11，14]等，如我國行業標準HJ 809-2016[15]采用氣相色譜法測定水中的4種亞硝胺。研究表明，采用單純色譜或者低分辨質譜檢測的選擇性較差，易與干擾化合物重疊，產生假陽性[16]; 其中電子轟擊電離源（EI源）GC-MS[17]易產生無差別的離子碎片，給甄別干擾物和目標物帶來困難，而化學電離源（CI源）[16]等軟電離方式可產生更多有利于結構確證的分子離子信息。氣相色譜-串聯質譜（GC-MS/MS）[18]、液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）[19]具有相對較高的選擇性和靈敏度，如美國EPA 521方法[20]采用GC-MS/MS測定飲用水中7種亞硝胺。高分辨質譜具有高質量分辨率和高質量精度（質量偏差通常≤1 ppm），為復雜樣品基質中痕量物質的精準檢測提供了有力的技術保障，Planas 等[8]曾采用氣相色譜-磁質譜（分辨率6000/10000）測定了水中9種亞硝胺。本研究基于SPE結合氣相色譜-靜電場軌道阱高分辨質譜，建立飲用水中16種痕量亞硝胺的檢測方法。本方法具有非常高的靈敏度和準確度，適用于水中痕量亞硝胺的檢測。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Q Exactive GC Orbitrap型氣相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質譜儀，配有TriPlus RSH自動進樣器（美國Thermo Fisher公司）; 7890N-5977B型氣相色譜-質譜儀（美國Agilent公司）; TurboVap Ⅱ型自動氮吹濃縮儀（美國Biotage 公司）; 固相萃取裝置（美國Supelco公司）; Chromabond Easy、Chromabond HR-P 萃取柱（500 mg，6 mL，德國MN公司）; Supelclean ENVI-Chrom P萃取柱（250 mg，6 mL，美國Supelco公司）。

16種亞硝胺及2種內標NDMA-d6和NDPA-d14的標準品購自TCI、Sigma、Dr. Ehrenstorfer、Manhage、TRC等供應商，純度均大于95%; 正己烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇（色譜純，美國J.T. Baker公司）; 無水硫酸鈉（分析純，北京化學試劑有限公司）; 實驗用水為經Milli-Q凈化系統制備的超純水。

2.2?標準溶液配制

分別稱取50 mg標準品，用甲醇溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，得到1000 mg/L的單標儲備液。用乙酸乙酯配制10 mg/L的16種N-亞硝胺的混合儲備液以及2種內標混合儲備液，進一步配制0.5 mg/L的內標工作溶液，于-18℃避光保存。使用時根據需要用乙酸乙酯稀釋成0.01～500 μg/L的混合工作溶液，其中內標NDMA-d6和NDPA-d14的濃度均為50 μg/L。

將10 mg/L的混合儲備液用乙酸乙酯逐級稀釋，配制0.2～500.0 μg/L系列的標準溶液，內標物濃度為50 μg/L，分別進行測定，繪制標準曲線。

2.3?樣品前處理

在1 L水樣中加入50 μL 0.5 mg/L內標溶液后混勻靜置。Chromabond HR-P固相萃取柱依次用5 mL甲醇活化、 5 mL水平衡，然后將水樣以3 mL/min流速過柱，上樣完成后，抽干1 min。用10 mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，加入無水Na2SO4進行脫水，最后將上清液氮吹濃縮至0.5 mL，待測。

2.4?檢測條件

色譜條件：DB-35MS色譜柱（30 m×0.25 mm， 0.25 μm）; 載氣為高純氦氣（99.999%）; 進樣體積1 μL; 脈沖不分流進樣，脈沖壓力200 kPa，脈沖時間1 min; 載氣流速2.0 mL/min; 進樣口溫度250℃，傳輸線溫度250℃; 程序升溫：初始溫度為40℃，保持1 min后，以15℃/min速率升至270℃，保持5 min。

質譜條件：分辨率60000 FWHM（200 m/z）; EI電離源，離子源溫度280℃; 溶劑延遲3 min; 全掃描模式（Full-Scan），掃描范圍m/z 40～300。16種亞硝胺及2種內標的定性和定量離子見表1。

3?結果與討論

3.1?色譜-質譜條件優化

利用低分辨氣相色譜-質譜技術， 考察了弱極性的HP-5MS（30 m×0.25 mm， 0.25 μm）、中等極性的DB-35MS（30 m×0.25 mm， 0.25 μm）和DB-624（30 m×0.25 mm， 1.4 μm）、強極性的DB-WAX（30 m × 0.25 mm， 0.25 μm）4種色譜柱對16種亞硝胺的分離情況。色譜柱DB-624和DB-WAX具有較好的分離效果，然而DB-624對于物質3、14、15、16的響應低，檢測過程中發現會明顯影響其靈敏度; DB-WAX不能分離6、8兩個物質，但這兩種物質具有相同的監測離子106.065，若不分離，則難以分別檢測; HP-5MS分離效果最差，且物質1、14、15響應低; DB-35MS對各物質的響應均較好，對于共流出色譜峰能夠通過提取特征離子將其有效分離，不影響定性和定量分析，且色譜柱熱穩定性較好（340℃）。因此選用DB-35MS色譜柱進行后續研究。

Q Exactive-GC質譜儀在60000分辨率下全掃描能達到每秒7張譜圖以上的采集速率，使數據獲得足夠多的掃描點數; 同時質量誤差在1 ppm以內，保證了數據的穩定性和可靠性。歐盟EC/657/2002關于質譜定性要求必須達到4個確證點（ Identification point，IP），高分辨質譜對精確質量數進行全掃描測定，每個離子被定義為2個確證點，一個定量離子和一個輔助定性離子的確證點即可達到4個，從而實現同時定量和定性確證。16種亞硝胺及2種內標物的定量和輔助定性離子見表1。

為了得到較高的靈敏度，對于質譜離子源溫度、色譜載氣流速、進樣方式以及脈沖壓力進行了優化。各物質峰面積隨離子源溫度的升高而增大，280℃之后保持相對穩定，較高的溫度有利于提高離子化效率及適當改善峰拖尾現象。較大的載氣流速有助于提高物質的出峰時間，進而得到較為尖銳的峰形減少峰拖尾現象，載氣流速2.0 mL/min時大多數物質響應值較高。脈沖不分流的效果優于不脈沖，這是由于脈沖進樣方式在進樣口施以較高壓力，使物質能快速進入色譜柱，減少在進樣口的分解及損失，同時有利于得到尖銳對稱的峰形。通過對脈沖壓力進行優化，發現在200 kPa時達到最高點，并在之后趨于穩定，因此選擇脈沖不分流且脈沖壓力為200 kPa。

3.2?固相萃取條件優化

根據本課題組前期研究及文獻報道[21]，選取填料為苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的3種SPE柱用于正交實驗，分別是Chromabond HR-P、Supelclean ENVI-Chrom P和Chromabond Easy。16種N-亞硝胺的正辛醇-水分配系數（lgkow）范圍為0.57～3.90，從水溶性到油溶性均有分布，因此選取了3種不同lgkow值的洗脫溶劑，分別是正己烷、乙酸乙酯和丙酮，其中正己烷（3.29）為親油性，乙酸乙酯（0.86）為親油性同時有一定的親水性，丙酮（0.24）為親水性。

選用四因素三水平正交表（L9（34））對固相萃取條件進行優化，實驗設計見表2，考察各實驗條件下萃取亞硝胺含量1 μg/L的100 mL水溶液（換算成待測溶液濃度為200 μg/L）的回收率情況。結果表明，采用乙酸乙酯作洗脫溶劑時，各亞硝胺的回收率較好，可能因為乙酸乙酯對水溶性和油溶性的目標物質均能較好地溶解并洗脫。而正己烷的親油性較強，對親水性的亞硝胺如NDMA溶解性較差，導致該物質的回收率極差。在9個正交實驗中，實驗2（A1B2C2）的回收率相對較好; 對實驗結果進行極差分析，得到各分析物的最佳固相萃取條件， 除了NDBA， 其它亞硝胺的最佳固相萃取條件都比較一致，只有洗脫量分布在兩個水平上，即8和10 mL。之后進行驗證實驗，采用Chromabond HR-P柱，8和10 mL乙酸乙酯，結果表明，10 mL乙酸乙酯的回收率更好，各物質均達到88%以上。因此，選擇Chromabond HR-P萃取柱進行固相萃取， 用10 mL乙酸乙酯洗脫。

3.3?方法學考察

3.3.1?線性范圍、檢出限及定量限?將不同濃度的混合標準溶液（含相同濃度的內標），由低濃度到高濃度依次進樣，繪制標準曲線。以3倍信噪比 （S/N≥3） 確定16種亞硝胺物質的檢出限，采用內標法進行定量分析，以S/N≥10得到方法的定量限，結果如表3所示。實驗結果表明， 各物質在線性范圍

3.3.2?方法回收率及精密度?通過在空白水樣中添加4個不同濃度的亞硝胺混標，進行6次平行檢測。由表4可知，本方法對于不同物質的回收率在72.4%～114.8%之間，RSD（n=6）在0.8%～9.5%之間。

與已報道的水中亞硝胺的檢測方法相比（表5），本方法可檢測的亞硝胺物質數量多（16種）、檢出限低（0.05～0.5 ng/L）、回收率較好，更為關鍵的是， 通過采用高分辨質譜檢測，各物質定性和定量離子質量誤差均小于1.839 ppm，保證了數據的穩定性和可靠性，且達到歐盟EC/657/2002規定的4個確證點，因此在進行痕量亞硝胺檢測時，本方法能夠有效排除基質干擾，準確度和靈敏度較高。

3.4?實際水樣分析

應用本方法對北京市內東城、海淀、朝陽、石景山、通州、大興等不同地區的12個自來水樣進行測定（表6），檢出了5種亞硝胺（NMPhA、NEPhA、NMOR、NDPhA、NDBzA），其中NMOR只在S1（Sample 1）中檢出，為0.9 ng/L，低于德國限量10 ng/L; 而對于檢出的其它亞硝胺，目前尚無限量要求，需要對其進行關注。

4?結 論

建立了飲用水中16種痕量亞硝胺的固相萃取-氣相色譜高分辨質譜檢測方法。在優化的儀器檢測條件及固相萃取條件下，16種物質的檢出限（LODs）為0.05～0.50 ng/L，遠低于目前各國的限量水平，同時高分辨質譜擁有超高的質量精度，各物質監測離子的質量數精確至0.00001，質量誤差小于1.839 ppm， 因此本方法具有非常高的選擇性和準確度，適用于水中痕量亞硝胺的確證檢測， 也為其它痕量物質的檢測提供了借鑒。

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