胃癌干細胞的研究進展△

申杰，李媛，徐桂華#

內蒙古自治區人民醫院1神經內科，2科研處對外合作與成果管理科，呼和浩特010017

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，也是導致惡性腫瘤患者死亡的第三大原因[1]。目前多學科聯合治療能夠改善晚期胃癌患者的預后[2]，雖然治療方面取得了很大的進步，但胃癌患者的預后仍然較差，5年生存率仍低于40%，主要原因是其具有頻繁復發、易轉移和強耐藥性的特點[3]。因此，研究胃癌頻繁復發、轉移和耐藥的關鍵機制非常重要。胃癌的耐藥、轉移和復發可能是由于胃癌干細胞（gastric cancer stem cell，GCSC）的存在[4]。有研究指出，在胃癌中CD44與CD133表達上調與多種臨床特征及不良預后相關，在胃癌患者中聯合檢測CD44和CD133對疾病診斷、預測預后方面具有重要作用[5]。除此之外，干細胞相關基因也可以作為胃癌的預后標志物。其中，miRNA-501-5p對于維持GCSC的干性至關重要，還與胃癌患者的生存率呈負相關，說明miRNA-501-5p也可作為預后的預測因子[6]。部分臨床前研究提出通過抑制干細胞相關基因的表達能夠靶向治療GCSC，這可能為其臨床應用奠定理論基礎，為胃癌新的預后標志物和有效的治療策略提供了參考。本文主要總結目前關于GCSC的調控機制，有助于系統地了解GCSC，以期為胃癌發生機制的研究奠定基礎。

1 GCSC的分離與鑒定

GCSC的分離、鑒定是研究其潛在機制和功能的關鍵。多項研究表明，在添加生長因子的無血清懸浮培養基中，腫瘤干細胞可以形成球狀細胞，保持自我更新特性。這些細胞具有無限增殖、自我更新的特性，并有相關基因表達增加，如CD44、八聚體結合轉錄因子4（octamer-binding transcription factor 4，Oct4）、性別決定區Y-box轉錄因子2（sex determining region Y-box transcription factor 2，SOX2）、ATP結合亞族G成員2（ATP binding cassette subfamily G member 2，ABCG2）、NANOG 等[7-8]，因此成球實驗被認為是獲得GCSC的一種簡便方法。然而由于缺乏微環境的刺激，在成球過程中干細胞的特性可能發生改變。利用Hoechst 33342標記GCSC，能夠通過流式細胞儀從側群細胞（side population cell，SP）中富集 GCSC[9]。胃癌細胞中的SP對5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）和多柔比星具有較強的耐受能力，移植到免疫缺陷的NOG小鼠后，產生腫瘤的能力增強[10]。但由于Hoechst 33342對細胞有毒性，可能會對實驗的準確性造成一定的影響。研究發現利用長春新堿處理胃癌細胞能夠顯著增加腫瘤球形成能力，并使干細胞相關基因的表達增加，如CD44、SOX2、Oct4和Musashi-1，這表明長春新堿處理也可用于富集GCSC[11]。

盡管GCSC分離標志物的特異性存在爭議，但越來越多的證據表明這些標志物也能用來富集GCSC。CD44是第一個被發現的GCSC表面標志物，在腫瘤細胞對微環境的反應中起著關鍵作用。研究發現，SCID小鼠被注射（2～3）×104個CD44陽性胃癌細胞8～12周后，在皮膚和胃均能產生腫瘤；而注射（3～10）×104個CD44陰性胃癌細胞則不能產生腫瘤，表明CD44陽性胃癌細胞具有強致瘤性。此外，CD44陽性胃癌細胞還表現出較強的腫瘤球形成能力、耐化療能力和耐輻射能力[12-13]。同時表達CD44/CD24可用于富集胃癌中的GCSC[14]，與CD44/CD24均為陰性的細胞相比，CD44/CD24均為陽性的腫瘤細胞具有自我更新、增殖和腫瘤易復發的能力。從外周血中分離出的CD44/CD54均為陽性的細胞自我更新能力增強，表明CD44/CD54均為陽性的細胞可用于腫瘤組織及外周血中GCSC的鑒定[15]。RNA結合蛋白Musashi-1在維持干細胞未分化狀態中發揮著重要作用[16]。并且CD44/Musashi-1也可作為富集GCSC的表面標志物，研究發現CD44/Musashi-1均為陽性的胃癌細胞的增殖、自我更新能力和耐藥性均有所提高[17]。上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）結合CD44也可用于富集GCSC[18]。其他一些分子如CD90、CD71和富含亮氨酸重復序列G蛋白偶聯受體5（leucine rich repeat containing G protein-coupled receptor 5，LGR5），也被報道具有成為GCSC候選表面標志物的潛力[4,19-20]。

2 編碼蛋白質的基因對GCSC干性的調控

GCSC中一些異常表達的信使RNA（messenger RNA，mRNA）和蛋白質在維持GCSC中發揮著重要作用。磷酸化的細胞外信號調節激酶（phosphoryhted-extracellular signal-regulated kinase，p-ERK）介導GCSC中CD44和Oct4正反饋回路，參與維持胃癌細胞的干細胞特性，如耐藥性、高致瘤性和轉移能力。同時，通過選擇性mRNA剪接產生的CD44變異體（CD44 variant，CD44v）也有助于維持胃癌細胞的干細胞特性。xCT是谷氨酸-胱氨酸交換轉運體的輕鏈亞基，通過參與胱氨酸攝取和谷胱甘肽合成，在細胞內氧化還原平衡中發揮重要作用。CD44v可以與xCT相互作用，增加細胞內谷胱甘肽含量，進而增加胃癌細胞對氧化應激的抵抗力[21]。在臨床研究中發現晚期胃癌患者接受xCT抑制劑柳氮磺胺吡啶治療后，陽性表達CD44v的干細胞比例降低，提示柳氮磺胺吡啶聯合化療可能改善胃癌患者的預后。另一種與干細胞相關的SOX2在GCSC中表達增加，對腫瘤球形成能力和多柔比星抗性有顯著作用[22]。干細胞相關基因BMI1在SGC7901和MKN45細胞系的球形細胞中過表達，且BMI1與Oct4、SOX2、NANOG、CD44、CD133等多種干細胞標志物表達呈正相關。BMI1能夠通過蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱 AKT）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路介導miRNA-21的激活，對干細胞干性有正向調控作用[23]。

許多研究已經明確了經典的干細胞相關信號通路在GCSC中具有調節作用。WNT/β-catenin通路在維持干細胞特性中的重要作用受到越來越多的關注[24]。據報道，溶質載體家族34成員2（solute carrier family 34 member 2，SLC34A2）可誘導激活WNT/β-catenin信號，以及增強CD44陽性GCSC的自我更新和耐藥能力。進一步研究顯示，SLC34A2通過結合miRNA-25啟動子區域能上調miRNA-25的表達，從而抑制糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase 3β，GSK3β）表達，激活WNT/βcatenin信號通路[25]。有研究發現，在CD44陽性胃癌細胞中Notch1信號通路被激活。γ-分泌酶能抑制Notch1的自我更新、腫瘤發生和CD44陽性胃癌細胞的遷移能力以及化療耐藥性，表明Notch1信號對GCSC至關重要[26]。

3 非編碼RNA對GCSC干性的調控

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）大致分為兩類：小于等于200個核苷酸的小RNA和大于200個核苷酸的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）。越來越多的證據顯示，微小RNA（microRNA，miRNA）在GCSC中具有調控功能。通過miRNA微陣列分析發現，MKN-5細胞通過流式細胞儀分選出SP與其他細胞之間的miRNA表達模式存在差異[27]。球狀體形成細胞與MKN-5細胞系的親本細胞miRNA表達模式也有顯著差異。這些miRNA與調控多能性的信號通路有關，如轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/SMAD、WNT/β-catenin 和 Notch 信號通路[28-29]。因此，miRNA表達活性也參與調控GCSC干細胞特性的調控。

miRNA-196-5p能調控CD44陽性GCSC的活性，其調控機制為直接抑制3'-UTR SMAD4表達從而增強CD44陽性GCSC的自我更新能力[30]。與此同時，miRNA-106b通過激活TGF-β/SMAD信號通路，能夠使GCSC維持干細胞特性[29]。報道稱一些miRNA可能通過WNT/β-catenin途徑對GCSC的特性起到調控作用。例如，miRNA-483-5p通過激活WNT/β-catenin信號通路可以促進GCSC生長和自我更新[31]。miRNA-501-5p通過直接下調Dickkopf相關蛋白1（dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 1，DKK1）、WNT信號通路NKD抑制劑（NKD inhibitor of WNT signaling pathway 1，NKD1）、GSK3β表達激活WNT/β-catenin信號通路，有助于增強GCSC的干細胞特性[6]。在CD44/EPCAM均為陽性的胃癌細胞的成球過程中，miRNA-19b、miRNA-92a、miRNA-20a表達逐漸下降。miRNA-19b、miRNA-92a、miRNA-20a可顯著增強GCSC的耐藥性、自我更新能力和致瘤性，其機制推測為miRNA-19b、miRNA-92a、miRNA-20a可直接抑制WNT通路的阻滯劑E2F轉錄因子1（E2F transcription factor 1，E2F1）和同源域相互作用蛋白激酶1（homeodomain interacting protein kinase 1，HIPK1），進而激活WNT/β-catenin信號通路。通過分析97例胃癌患者胃癌組織中的miRNA-92a表達水平發現，miRNA-92a可作為胃癌的預后因子[32-33]。同時，miRNA也可以調控Notch信號通路，進一步調控GCSC的多能性。

N2IC是Notch2受體的活化形式，其通過上調環氧化酶-2導致胃癌發生[34]。研究發現，GCSC中N2IC、ETS原癌基因1（ETS proto-oncogene 1，ETS1）、miRNA-23b的負反饋通路，在調控GCSC多能性中發揮重要作用[35]。通過沉默N2IC、ETS1，可抑制腫瘤球形成能力，并使CD44、Nanog、SOX2等干性基因的表達降低。過表達N2IC和ETS1可能起到相反的作用，刺激E2F1的表達，進而抑制miRNA-23b的表達。并且研究發現ABCG2通過SP調控維持干細胞特性，促進胃癌耐藥性[36]。miRNA-132可以增強LGR5陽性GCSC患者對順鉑的耐藥性，可以直接抑制SIRT1的表達維持CERB的活化，最后導致ABCG2的表達水平增加[5]。

lncRNA作為ncRNA的一員，通過與DNA、RNA、蛋白相互作用調控染色質重疊、選擇性剪接和轉錄機制，以順式或反式的方式調控基因表達[37]。有研究發現lncRNA調控蛋白在GCSC中具有調控作用[38]。在CD133陽性的GCSC中過表達lncRNA調控蛋白，能促進GCSC的增殖和侵襲，同時可上調Oct4、SOX2、NANOG等多能基因的表達。

4 GCSC的臨床研究進展

胃癌頻繁復發可能主要是由于對非GCSC抗腫瘤治療引起的[39]。由于GCSC在耐藥性和腫瘤轉移中的作用，針對維持腫瘤干細胞關鍵靶分子的治療可以改善胃癌患者預后[40]。目前提出幾種關于干性相關基因的靶向療法用于特異性消除GCSC。

納米技術具有在特定部位裝載診斷和治療化合物的能力，有助于腫瘤預防、診斷和治療[41-42]。CD44在GCSC中具有重要作用，利用抗體引導CD44靶向治療也是種有效的抗腫瘤策略。在Ⅰ期臨床試驗中測試了幾種CD44v6-特異性抗體，均具有良好的腫瘤靶向治療效果[43-44]。合成的納米探針GNS-PEG-CD44v6通過干擾CD44的功能，誘導CD44陽性細胞介導的GCSC清除，進一步調控腫瘤形成。在小鼠皮下注射GNS-PEG-CD44v6標記的GCSC細胞，照射紅外激光兩周后發現，腫瘤體積減小，表明該探針在GCSC靶向治療中的潛在應用[45]。

RNA干擾誘導小分子工具正在開發中，用于抑制干細胞相關基因的表達。miRNA-34a通常在腫瘤組織中表達下調，是CD44的負調控因子[46]。納米囊泡介導的PLI/miRNA-34a通過納米級穩定的miRNA-34a遞送系統靶向GCSC，在體內顯著抑制CD44表達，并誘導腫瘤細胞凋亡，具有良好的抗腫瘤作用[47]。聯合應用核酸和抗腫瘤藥物也是減少腫瘤干細胞和非腫瘤干細胞數目的有效方法。含有miRNA-200c和多西紫杉醇（docetaxel，DOC）的穩定凝膠刺激納米顆粒具有較好的腫瘤細胞靶向能力和協同抗腫瘤作用。研究發現miRNA-200c/DOC納米顆粒可以改善E-鈣黏蛋白表達，降低CD44表達，降低腫瘤形成能力[48]。

此外，分化治療也是種有效抑制腫瘤干細胞增殖的方法。無調性bHLH轉錄因子1（atonal bHLH transcription factor 1，ATOH1）是一種基本的螺旋-環-螺旋轉錄因子，在誘導腸上皮細胞分化中起重要作用[49]。GCSC中ATOH1的過表達能夠降低干性基因的表達水平，同時增加各種分化標志物的表達，進而降低體外GCSC的成球能力以及體內腫瘤形成能力[50]。這表明ATOH1可作為分化療法用于根除GCSC。全反式維甲酸（alltrans retinoic acid，ATRA）被證明可有效誘導GCSC的分化，表現為胃上皮分化標志物的表達增加，如細胞角蛋白、黏蛋白6（mucins 6，MUC6）和三葉肽因子3（trefoil factor 3，TFF3）；并且治療后腫瘤球中干細胞相關基因表達下調。ATRA預處理的腫瘤球注射到免疫缺陷小鼠體內，不會產生腫瘤；當用33 μmol/kg ATRA處理后注射，可明顯抑制腫瘤生長。說明ATRA可誘導GCSC分化，消除GCSC[51]。

5 小結與展望

目前在GCSC所涉及的分子調控機制方面已經取得了很大的成就。干細胞相關的mRNA、蛋白和ncRNA在干細胞特性調控中發揮著重要作用，有望成為胃癌患者預后標志物或特異性靶點。越來越多的證據表明GCSC在耐藥、腫瘤轉移和復發中起著關鍵作用[52-53]。干細胞相關基因可能對腫瘤干細胞發展有幫助，也可能與胃癌患者的不良預后密切相關。這也表明GCSC在胃癌中的重要性，靶向清除GCSC可能是提高惡性腫瘤患者預后的最有效方法。分化療法、納米技術和基于當代表觀遺傳工具的療法，在抑制GCSC方面具有應用前景。未來需要進一步評估其體內效應，確定其是否可以改善胃癌患者的預后。為了實現GCSC靶向治療在臨床中的應用，仍有許多工作要做。此外，正常干細胞與GCSC有一些共同的干性相關基因，如何在不影響正常組織干細胞的情況下選擇性靶向GCSC仍然是一個很大的難題，有待進一步研究。