創傷弧菌生物學特性和檢測技術研究進展

王青柏，李良秋，徐 鵬，曾綺文，王東東，王嘉銘，譚雨婷

(廣東省微生物研究所，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東省微生物應用新技術公共實驗室，省部共建華南應用微生物國家重點實驗室，廣東廣州 510070)

創傷弧菌(Vibriovulnificus)是人類和水產養殖動物的重要病原弧菌，廣泛存在于海水及河口環境中[1]。2000年，美國疾病控制中心首次從腹瀉患者糞便中分離出一種嗜鹽性的革蘭陰性細菌[2]。2007年Bross等[1]從膿毒癥患者血液中分離培養出同種細菌，引起了大家的普遍關注，該菌于1979年被命名為Vibriovulnificus。隨后，美國、日本等國家相繼報告創傷弧菌感染臨床病例，姜紅[3]于1991年報道了我國首例創傷弧菌引起的原發性敗血癥。2006年，創傷弧菌被列入最危險的細菌，與霍亂弧菌、副溶血性弧菌并列為威脅人類健康的三大弧菌[4]。近年來，隨著氣候變暖以及進食海鮮的人群變多，我國創傷弧菌感染率呈現上升趨勢[5-8]。人感染創傷弧菌往往與食用受污染的海產品及創口暴露于海水有關，臨床癥狀主要表現為原發性敗血病和嚴重的創口感染，此外，還可引起腸胃炎、肺炎、腦膜炎等，其中引起的原發性敗血病在免疫功能低下的人群中死亡率高達50%～60%[9]。在水產養殖中，創傷弧菌可使許多種經濟動物患病，如羅非魚[10]、蝦南美白對蝦[11]、金鯧魚[12]、安圭拉鰻魚[11]、鱘魚[13]、石斑魚[14]等。最近，我國學者首次報道了從患病的淡水魚草魚中分離出創傷弧菌[15]。草魚是我國主要的養殖淡水物種之一，年產量超過580萬t，也是世界水產養殖中最大的魚類產量[15]。

創傷弧菌的感染不僅對人類健康造成重大危害，也給水產養殖業帶來巨大經濟損失，而且我國海產品品種豐富多樣，每年因食用海產品而引起食物中毒、急性胃腸炎或腹瀉等疾病屢有報道。因此研究創傷弧菌的生物學特性及檢測技術具有重要意義。

1 生物學特性

創傷弧菌是一種低度嗜鹽菌，存在于鹽度為0.08%～3.50%的水體中[16]，屬于弧菌科(Vibrionaceae)弧菌屬(Vibrio)。該菌為革蘭氏陰性細菌，菌體短小，呈稍彎曲的逗點狀，有極端單鞭毛，有動力，單獨存在或尾端相連成“C”或“S”型，氧化酶陽性，無芽孢，適于生長在堿性環境中，對酸性環境敏感，在低于13 ℃的環境下不生長，在無鹽培養基上不生長[3]。創傷弧菌在固體培養基中呈多樣性，在選擇性培養基TCBS上呈綠色菌落，而在改良的mCPC瓊脂上呈帶黃色暈環的黃色菌落。它是一種重要的水產品污染病原，可造成養殖水產品的病害，同時也是一種致命的人類機會致病菌，與全世界大部分食用污染海鮮致死的案例有關[17]。根據生化血清學試驗和受感染宿主的不同，目前將創傷弧菌分為3種生物型[18]：生物Ⅰ型主要感染人類，通常零星發生；生物Ⅱ型主要引起鰻魚的疾病，但是也有少數感染人的報道；生物Ⅲ型于1996年首次報道，可引起人類敗血癥和軟組織感染。創傷弧菌的致病性是多種致病因子共同作用的結果，主要致病因子包括溶血素、MARTX毒素、鐵載體、莢膜多糖、脂多糖以及金屬蛋白酶等。

1.1溶血素溶血素(vibrio vulnificus haemolysin，VVH)是創傷弧菌分泌至胞外的一種穿孔毒素(pore-forming toxin)，是創傷弧菌重要的毒力因子之一，參與了細菌入侵宿主的毒力機制，通過破壞腸道黏膜組織協助創傷弧菌從腸道侵入到血液[5]。VVH能特異性結合膽固醇，在細胞膜上組裝成低聚體[19]，進而形成離子滲透孔(ion-permeable pores)破壞細胞膜的屏障功能，導致紅細胞破裂、溶解[20]，上皮細胞凋亡[21]。溶血素基因vvhA編碼的多肽與霍亂弧菌埃爾托型和霍亂弧菌非01群的溶血素的第一區及第二區的氨基酸分別有65%和60%的相似度，通過Ⅱ型分泌途徑被分泌到胞外[22]。

1.2MARTX毒素MARTX(multifunctional-autoprocessing repeats-in-toxin)毒素，是創傷弧菌重要的毒力因子之一，分子量巨大，由4 000多個氨基酸殘基組成，屬于重復子毒素家族(RTX)，在其C段重復出現9個串聯的氨基酸的特殊分子結構[23]。MARTX毒素是創傷弧菌抵抗宿主免疫防御的一個重要工具，穿過宿主細胞膜時，會把自己分割成小分子效應因子進入到細胞質中。釋放的效應因子通過作用于宿主細胞的信號通路，有效地抑制了由Rac1調節的巨噬細胞免疫吞噬作用、細胞遷移和抗菌氧自由基的產生[24]。小鼠疾病模型研究表明，MARTX毒素和VVH這2種毒力因子缺少其中任何一種，創傷弧菌臨床分離株就不能使小鼠致病，MARTX毒素可能通過與VVH相互協作，共同促使腸道黏膜的炎癥快速發展，致使上皮細胞變性壞死[25]。

1.3鐵載體鐵攝取系統是創傷弧菌的關鍵致病因子[26]。鐵是幾乎所有生物體必需的微量營養素，從環境中獲取鐵對細菌至關重要。然而，由于血液中的鐵通常與鐵螯合蛋白如轉鐵蛋白和乳鐵蛋白以高親和力結合，人體中的可溶性鐵是非常有限的，不能維持細菌生長。創傷弧菌可通過表達兒茶酚鐵載體(vulnibactin)和異羥肟酸鐵載體來攝取鐵，其中酚鹽類鐵載體是其主要的方式[27]。研究表明，當兒茶酚鐵載體相關基因(vuuA、venB、vvsA、vvsB)發生突變時，創傷弧菌菌株的毒力將會降低[28]。

1.4莢膜多糖莢膜是構成細菌與外界環境之間的一道屏障，是許多病原菌重要的毒力因子之一。莢膜對細菌入侵過程中的黏附、逃避巨噬細胞吞噬作用以及促進全身感染是十分必要的。莢膜也是創傷弧菌的一個重要致病因子[29]，創傷弧菌的菌落形態及毒性作用與其莢膜的表達密切相關，菌落透明的創傷弧菌不產生莢膜，對小鼠不具有致病性，而菌落不透明的創傷弧菌產生莢膜，對小鼠有致死性[30]。

2 創傷弧菌檢測技術研究進展

目前，生化特征仍是弧菌鑒定分類的常用方法，但是這種方法操作繁瑣又耗時費力，易受人員的主觀判定干擾，而且弧菌屬主要病原菌表型相似性較高，弧菌屬細菌的生化特征不穩定，給弧菌的鑒定帶來了很大困難和不確定性，弧菌的鑒定結果也經常不準確。而一些商業化的微生物快速檢測系統如API VITECH等的檢測原理也是根據生化反應，對致病性弧菌的檢測準確度不高，不利于病原菌的確定和治療措施的及時應對[31]。隨著檢測技術的不斷發展，微生物的檢測已從傳統的生化、免疫學方法逐漸發展為基因水平的檢測。常規PCR及其衍生技術在創傷弧菌的快速檢測中不斷得到運用和發展。

2.1常規PCR技術Hill等[32]基于vvhA基因首次建立了創傷弧菌的PCR檢測方法，對5株創傷弧菌和22株其他細菌進行PCR擴增，所測創傷弧菌都得到一條519 bp的特異性條帶，而其他菌株沒有特異性擴增，對于經堿性蛋白胨水(alkaline peptone water,APW)24 h增菌的人工染菌牡蠣樣品，檢出限為100 CFU/g。Kumar等[33]建立的基于gyrB基因的海產品創傷弧菌PCR檢測方法，所測創傷弧菌都出現一條28 bp的特異性條帶，其他弧菌和非弧菌細菌無特異擴增。對于不經過增菌步驟的人工染菌牡蠣，該法的檢出限為300 CFU/g，而對于APW 18 h增菌的樣品，檢出限為30 CFU/g。PCR方法雖然實現了致病菌的快速檢測，但如何避免假陽性結果仍然是一個挑戰，需要非常嚴格的引物設計，包括引物特異性、引物長度、解鏈溫度、GC含量、較少的二級結構和PCR退火溫度，以實現其高特異性。

2.2多重PCR技術隨著PCR技術的廣泛應用，由基本的PCR原理衍生出的改進方法不斷出現，其中多重PCR技術(Multiplex PCR)具有高效、快捷和特異性高等優點，能夠同時擴增出多個核酸片段，克服了單重PCR缺點，可實現對同一基因組多個位點或不同基因組多個位點的同時檢測。張新中等[34]采用多重PCR的方法同時檢測創傷弧菌gyrB基因的3個位點，設計的3對引物分別擴增得到481、702和1 065 bp的DNA片段，能夠更為準確地甄別病原體，該方法的靈敏度為102 CFU/mL。Lee等[35]采用多重PCR的方法同時檢測純培養物和染菌牡蠣中鼠傷寒沙門氏菌、創傷弧菌、霍亂弧菌和副溶血性弧菌的，發現染菌牡蠣勻漿3 h增菌后的創傷弧菌檢出限為100 CFU/g。Bauer等[36]建立了基于toxR基因的多重PCR方法檢測創傷弧菌、霍亂弧菌和副溶血性弧菌，如果已知待測菌株的原始菌落形態，該法的效果良好，否則溶藻弧菌會對結果產生影響。Tarr等[37]建立了檢測霍亂弧菌、副溶血性弧菌、創傷弧菌和擬態弧菌的多重PCR方法，對190株代表菌株的基因組進行擴增，均出現特異性擴增片段，由于多重PCR反應體系中多對引物同時擴增，如果試驗條件控制不當，容易出現擴增失敗或非特異性擴增。成功的多重PCR方法是基于引物的特異性以及多對引物對濃度、退火溫度、底物濃度達到平衡的狀態，因此引物的設計及對反應體系和反應條件的不斷優化是建立該方法的關鍵所在。

2.3DPO-PCR技術PCR技術的特異性取決于引物與模板DNA之間互補的程度，因此，引物的設計對于PCR特異性反應顯得尤為重要[38]。2007年韓國Seegene公司首次提出一種新型的聚合酶鏈式反應引物設計方法即雙啟動寡核苷酸引物(dual primingoligonucleotide，DPO)，提高了PCR反應特異性[39]。最近，Xu等[40]基于DPO技術建立了DPO-多重PCR方法檢測海產品中霍亂弧菌、創傷弧菌、溶藻弧菌和副溶血性弧菌等4種主要致病菌，設計的特異性引物分別靶向霍亂弧菌mdh、創傷弧菌vvhA、溶藻弧菌colH和副溶血性弧菌toxR基因；為了測試其特異性，該研究使用了396種細菌菌株，包括209種目標菌株和187種其他細菌菌株，結果顯示特異性PCR產物僅在靶細菌菌株中觀察到。與常規PCR檢測相比，該DPO-多重PCR方法允許在更寬的退火溫度(48～68 ℃)下有效擴增靶基因，對于每種弧菌的純培養物或人工污染的食物基質樣品，其分析檢測限均小于1.510 CFU。可見，多重PCR中引入DPO引物技術，大大提高了多重PCR檢測結果的靈敏度及特異性。

2.4RT-qPCR技術實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)自1996年由美國AppliedBiosystems公司推出后，實現了PCR從定性到定量的飛躍，該技術是利用反應體系中熒光信號的積累實時監測整個PCR的進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析[41]。RT-qPCR結合了常規PCR的核酸擴增高效性，探針技術的高特異性，光譜技術的高敏感性和高精確定量等多種優點，且操作完全封閉，儀器直接讀數，結果判斷更加客觀真實。通過查詢中國標準在線服務網(http：//www.spc.org.cn)發現，截至目前，我國頒布的基于PCR技術的國家和行業標準有305個，其中涉及實時熒光PCR的有180個，約占60%，說明實時熒光定量PCR技術的準確性、可靠性及高效性得到各個行業的認可，也為實時熒光定量PCR技術的推廣應用奠定基礎。王紫薇等[42]在北京市市場隨機采集的105份海產品進行創傷弧菌檢驗，并比較了RT-PCR法和VITEK鑒定方法的準確性，結果發現，105份海產品中，有40份樣品檢出創傷弧菌，檢出率為38.10%；其中，蝦類產品檢出率高達52.38%，其次為貝類產品( 37.88%)和魚類產品(22.22%)；經rpoB基因測序驗證，RT-PCR和VITEK方法的準確率分別為100.00%和67.50%。但是RT-qPCR的熒光信號容易受樣品基質、培養基、核酸提取試劑等抑制，導致其檢測敏感性顯著降低，影響了該精確定量技術的適用性，而且探針成本較高、檢測儀器昂貴、操作要求高等諸多因素給RT-qPCR在基層的推廣應用帶來一定困難。另外一個局限性是該技術只能對反應體系中模板DNA進行定量，無法鑒別污染樣品的細菌是死菌還是活菌。

2.5MPN-PCR技術最大可能數(most probable number MPN)法是依據試驗結果計算出目標菌統計學上的估計值，是常用的微生物半定量檢測方法[43]。MPN法的試驗過程涉及細菌的復蘇和選擇性富集，可以在大量雜菌存在條件下檢出活的目標菌。國家食品安全風險評估中心2015年發布的《國家食品污染和有害因素風險監測工作手冊》中8種食源性致病菌的定量檢測方法，除了銅綠假單胞菌外均推薦了MPN法[44]。將PCR技術和MPN法的結合應用也越來越多，這提高了檢測速度，也提高了檢測敏感性。Bonny等[45]結合MPN法和多重PCR技術建立了MPN-多重PCR方法，定量檢測樣品中副溶血性弧菌、霍亂弧菌和創傷弧菌；該研究共分析了120份魚樣，副溶血性弧菌、霍亂弧菌和創傷弧菌的患病率分別為48.33%、27.00%和32.50%；當應用單純化MPN-PCR時，在P<0.05時獲得類似的結果，驗證了多重MPN-PCR的準確性；所測試的樣品中副溶血性弧菌、霍亂弧菌以及創傷弧菌的污染量分別為0～2.43×106、0～2.16×106和0～4.93×105MPN/g。

2.6LAMP技術常規PCR檢測、多重PCR及熒光定量PCR檢測雖然特異性和敏感性強，但是需要專業人員操作，所需設備儀器比較昂貴，一定程度上阻礙了這種方法的廣泛應用。環介導恒溫擴增技術(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)是由日本學者Notomi于2000年首次報道的一種適用于基層診斷的恒溫核酸擴增技術[46]，此技術在恒溫條件下即可完成核酸的擴增，具有耗時少、成本低、技術要求低等優點，近年來已被廣泛用于病毒、細菌、寄生蟲等各種病原體的相關研究。Ren等[47]首次建立了基于溶細胞素基因的創傷弧菌LAMP檢測方法，利用該方法對31株菌株進行檢測，結果顯示，LAMP反應對創傷弧菌具有高度特異性，且比常規PCR靈敏10倍。別闖南等[48]分別以創傷弧菌溶血素A基因(hemolysin gene A，HA)和多重毒素(repeats in toxin，RTX)毒力基因的保守序列作為靶序列設計內、外引物，建立了快速檢測致病性創傷弧菌2種毒素的LAMP方法，該LAMP檢測創傷弧菌的2種基因的靈敏度都達10 CFU/mL。在人工模擬樣品檢測中，LAMP結果顯示，采用水煮法提取DNA，從樣品處理到報告結果耗時1.5 h，魚肉中創傷弧菌的檢出限為1×102CFU/g(RTX)和1×104CFU/g(HA)；采用同樣方法提取DNA進行普通PCR，其檢出限為1×103CFU/g(RTX)和1×104CFU/g(HA)，耗時4 h。

3 結語

創傷弧菌是一種重要的海洋動物病原菌，可造成養殖水產品的病害。同時也是一種致命的人類機會致病菌，與全世界大部分食用污染海鮮致死的案例有關[49]。創傷弧菌由于對易感人群的高致死率，也被稱為“食肉細菌”，引起的原發性敗血癥的死亡率超過50%[50]。除了原發性敗血癥之外，通過接觸存在有創傷弧菌的海水或海產品引起的傷口感染，死亡率約為25%[51]。因此，對創傷弧菌生物學特性的深入了解以及病原菌快速檢測顯得尤為重要。由于創傷弧菌在低于13 ℃的溫度下不能生長，因此可以利用這點，在食用海鮮產品前將海鮮產品冷卻至低于此溫度保藏幾個小時，以最大限度地降低感染風險，當然這會影響海鮮產品的新鮮度和口感。由于創傷弧菌感染通常是致命的，并且預后與診治的速度、準確度直接相關。因此，建立一種快捷、簡便、實用性強的檢測方法對于創傷弧菌感染的早期診斷和及時治療是至關重要。隨著分子生物學技術的不斷發展，PCR及其衍生技術也在不斷地改進，更多新的、優秀的創傷弧菌快速檢測技術將不斷涌現，使包括創傷弧菌在內的病原微生物的檢測更加準確、特異與靈敏。