肝細胞癌患者癌組織miRNA-30c水平變化及其臨床意義探討*

王虎明，樊東升，徐杰，劉險峰，周寧，麗敏，包娜娜

微小RNA（miRNA）是一類長度為12～23個核苷酸的內(nèi)源性小分子RNA[2-4]。miRNA-155可以通過調(diào)節(jié)SOX6信號通路，促進PLC的侵襲[5，6]。miRNA-520和miRNA-99a可以作用于細胞周期蛋白，進而抑制PLC的生長[7，8]。本研究分析了PLC患者肝癌組織miRNA-30c水平變化與病理學(xué)指標的關(guān)系及其對患者預(yù)后的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年2月2012年11月我院收治的PLC患者35例，男性21例，女性14例；年齡49～68歲，平均年齡（55.2±3.7）歲。所有患者均經(jīng)過組織病理學(xué)檢查診斷為肝細胞癌（HCC）。術(shù)前未經(jīng)過放化療治療。本研究已經(jīng)過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

1.2 肝組織miRNA-30c檢測 將切除的癌組織立即用冰PBS緩沖液沖洗，剪至黃豆粒大小后，放入液氮中冷凍，過夜后置入-70℃冰箱中保存、待測。采用RNA提取試劑盒（南昌樂悠生物科技有限公司）提取RNA。采用TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（南昌樂悠生物科技有限公司），即實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)法檢測成熟體miRN-30c水平。將RUN6作為內(nèi)參進行檢測。miRN-30c和RUN6引物序列均由深圳市華安平康生物科技有限公司設(shè)計合成。本實驗采用兩步法檢測miRN-30c水平。采用公式2-△ct計算miRNA-30c相對水平，即△ct=ctmiRNA-30cctRUN6。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（±s）表示，采用 t檢驗，癌組織miRNA-30c水平與臨床和病理因素的風險比（OR）和95%可信區(qū)間（CI）采用Logistic二項回歸分析。采用Kaplan-Meier最小乘積法評價患者的生存率，不同miRNA-30c水平患者生存率的差異比較采用Log-Rank檢驗。P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床和病理學(xué)因素HCC患者肝組織miRNA-30c水平比較 不同性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、TNM分期、有無肝炎病史和血清AFP水平高低患者肝組織miRNA-30c水平差異無顯著性統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者肝組織miRNA-30c水平顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表 1）。

表1 不同臨床和病理學(xué)因素患者肝組織miRNA-30c水平（±s）比較

表1 不同臨床和病理學(xué)因素患者肝組織miRNA-30c水平（±s）比較

例數(shù) miRNA-30c P性別 男 21 0.5±0.1 ＞0.05女14 0.6±0.0年齡(歲) ≥50 14 0.5±0.1 ＞0.05＜50 21 0.5±0.1腫瘤大小(cm) ≥3 22 0.6±0.0 ＞0.05＜3 13 0.5±0.0分化 低分化 12 0.6±0.0 ＞0.05中/高分化 23 0.6±0.1 TNM分期 Ⅰ/Ⅱ 12 0.5±0.1 ＞0.05Ⅲ/Ⅳ 23 0.6±0.0淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 是 17 0.2±0.0 ＜0.05否18 0.8±0.1肝炎病史 有 25 0.6±0.0 ＞0.05無10 0.6±0.1 AFP(μg/L) ≥25 26 0.6±0.2 ＞0.05＜25 9 0.6±0.2

2.2 肝組織miRNA-30c水平的進一步回歸分析35例HCC患者癌組織miRNA-30c相對水平為0.6,95%CI為0.3～0.6，其中癌組織miRNA-30c相對水平低于0.6者13例，大于0.6者22例。經(jīng)Logistic二項回歸分析發(fā)現(xiàn)，不同性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、TNM分期、有無肝炎病史和血清AFP水平高低者癌組織miRNA-30c相對水平無顯著性差異（P＞0.05），而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者癌組織miRNA-30c水平顯著降低（P＜0.05，表 2）。

2.3 不同miRNA-30c水平患者生存比較 癌組織miRNA-30c高水平患者總生存期為（14.5±6.7）個月，95%CI為11.0～28.4個月，顯著長于低水平患者【（7.9±1.5）個月，95%CI為 3.2～10.7 個月，P＜0.05，圖 1】。

圖1 兩組生存曲線比較

表2 Logistic二項回歸分析不同臨床和病理學(xué)因素患者癌組織miRNA-30c水平差異

3 討論

PLC已成為全世界男性第五位、女性第7位最常見的惡性腫瘤，其死亡率在男性中為第2位，在女性中為第6位[11]。PLC是惡性程度高、易轉(zhuǎn)移和預(yù)后較差的一種腫瘤。由于缺乏特異性的生物學(xué)指標，使得早期診斷變得較為困難[12]。部分患者在確診時已經(jīng)發(fā)生浸潤或轉(zhuǎn)移，從而失去了最佳的治療時機。因此，深入地研究PLC的發(fā)病機制，對于早期診治有重大的意義。自Lee et al首次發(fā)現(xiàn)Lin-4以來，已經(jīng)有上千種miRNA在動植物體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)[13]。miRNA通過與目標堿基的配對，從而對靶基因的表達進行調(diào)控，對于細胞的分化、增殖、凋亡和對機體的發(fā)育有重要的作用[14]。近年來，大量研究表明miRNA表達譜與PLC的病理學(xué)類型、惡性程度、分級和分期等臨床病理學(xué)特征密切相關(guān)，檢測miRNA不僅可以優(yōu)化PLC的診斷和個體化治療，而且還能作為判斷PLC預(yù)后的工具[15]。例如，miRNA-423可以抑制抑癌基因的表達，從而促進PLC的形成[5]；miRNA-155可以通過調(diào)節(jié)SOX6信號通路，促進PLC的侵襲[6]，而 miRNA-520和miRNA-99a可以作用于細胞周期蛋白，進而抑制PLC的生長[7，8]。既往研究發(fā)現(xiàn)miRNA-30c可作為抑癌基因在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演重要角色[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-30c水平與PLC患者的預(yù)后有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、TNM分期、有無肝炎病史和血清AFP水平高低PLC患者癌組織miRNA-30c相對水平無顯著性差異（P＞0.05），但是，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織miRNA-30c水平顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步地經(jīng)Logistic二項回歸分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-30c低水平增加了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風險。研究結(jié)果可能暗示，癌組織miRNA-30c水平的高低對于診斷有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PLC患者有參考價值，需要今后進一步地進行研究。由于本組例數(shù)較少，還未能發(fā)現(xiàn)腫瘤分化程度、組織浸潤和腫瘤大小等因素對癌組織miRNA-30c相對水平的影響。在臨床實際工作中，還難以對各種影響因素進行精準的判定。由于我國HCC多發(fā)生在具有乙型肝炎肝硬化的患者，病毒因素肯定影響患者預(yù)后，而這些是否會影響癌組織miRNA-30c水平，均需要進一步研究。

miRNA-30c屬于miRNA-30家族成員。以往研究已證實，miRNA-30c與肺癌、乳腺癌、腎癌等有關(guān)[10，16，17]。但是，關(guān)于其與 PLC 的關(guān)系，則研究較少。現(xiàn)在看來，miRNA-30c對于PLC的診斷有重要的應(yīng)用價值。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miRNA-30c診斷PLC的受試者工作特征曲線（ROC）下面積（AUC）為 0.927，其診斷的靈敏度和特異度分別為81.84%和71.80%，與miRNA-203聯(lián)合診斷可將ROC曲線下面積提高至0.9378，診斷的靈敏度和特異度提高至84.51%和80.33%[18]。既往研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA-30c可以下調(diào)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（MTA1）來調(diào)控腫瘤細胞的增殖，其與核轉(zhuǎn)錄因子HMBOX1的3’端非翻譯區(qū)結(jié)合，使自然殺傷細胞的腫瘤壞死因子（TNF）-α表達水平增高，進而增加機體對PLC細胞的殺傷能力[19]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-30c在PLC組織中表達下調(diào)。在體外實驗中，通過上調(diào)miRNA-30c的表達可以抑制轉(zhuǎn)錄因子Snail水平，進一步降低了PLC細胞的侵襲性[20]。還有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-30c-5p對機體脂肪酸的合成有重要作用，可用以治療瘦素受體缺陷小鼠的甘油三酯堆積和肝脂肪變性[21，22]。本研究以癌組織miRNA-30c的平均水平為分界線，將患者分為低水平組和高水平組。結(jié)果表明，癌組織miRNA-30c高水平組患者總生存期顯著長于低水平組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示檢測癌組織miRNA-30c水平可能具有預(yù)示PLC患者術(shù)后預(yù)后的作用。