外泌體在肺癌發(fā)病機(jī)制及診療中的研究進(jìn)展

周斯悅 綜述,段 勇 審校

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科/云南省檢驗醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室/云南省實驗診斷研究所,云南昆明 650032)

外泌體是一種具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的球型納米級胞外囊泡，直徑50～100 nm[1]，最早由JOHNSTONE等[2]在研究綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟過程中發(fā)現(xiàn),由細(xì)胞膜內(nèi)陷后通過一系列復(fù)雜機(jī)制生成的多胞體(MVBs)釋放到細(xì)胞外環(huán)境中[3]。外泌體的形成與細(xì)胞分泌有關(guān)，受多種蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)，如Rab蛋白(Rab27A / B)、熱休克蛋白70(HSP70)、腫瘤易感基因101蛋白(TSG101)、ALG-2相互作用蛋白X(Alix)和四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81和CD82)[4]。在正常或病理條件下，幾乎所有類型的細(xì)胞都可分泌外泌體，如網(wǎng)織紅細(xì)胞、免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞，但腫瘤細(xì)胞能分泌更多的外泌體。外泌體含有多種生物活性分子，包括蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)，在許多病理及生理過程中發(fā)揮重要作用，并且能將信號分子傳遞給其他細(xì)胞從而改變其他細(xì)胞的功能，是細(xì)胞間信息傳遞的重要方式[5]。外泌體天然存在于體液中，包括血液、尿液、唾液、乳汁、膽汁、羊水、腹水及腦脊液等。

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，可分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)，前者占80%，具有易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、惡性程度高的特點(diǎn)。我國是肺癌高發(fā)國，2015年中國分地區(qū)腫瘤和死亡分析顯示，我國東、中、西部常見惡性腫瘤中肺癌均排名首位，也是腫瘤死亡的常見原因[6]。2012年肺癌在男性以及欠發(fā)達(dá)國家的腫瘤相關(guān)死亡原因中居首位，盡管針對肺癌診療的研究已經(jīng)取得較大進(jìn)展，但肺癌預(yù)后情況仍不理想，5年生存率并未明顯改善。主要原因是腫瘤得不到早期診斷，會發(fā)生早期轉(zhuǎn)移[7]。因此，迫切需要發(fā)掘有助于肺癌早期診斷的新型標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體參與調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的多個過程，包括促進(jìn)腫瘤血管形成、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫應(yīng)答、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移等。近年來，外泌體的研究特別是在腫瘤領(lǐng)域的研究是一個熱點(diǎn)。筆者就近年來外泌體在肺癌發(fā)病機(jī)制及診療中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，展望該領(lǐng)域的發(fā)展前景。

1 外泌體在肺癌發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移中的作用

1.1外泌體促進(jìn)腫瘤血管生成 腫瘤血管生成在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中有著關(guān)鍵作用，學(xué)者們已經(jīng)證實外泌體可促進(jìn)腫瘤血管生成。LIU等[8]的研究表明，外泌體中的miR-21可以激活STAT3，從而增加血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGF)的表達(dá)，最終誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞的血管生成和惡性轉(zhuǎn)化。CUI 等[9]研究表明過表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP-1)通過激活CD63/PI3K/AKT/HIF-1通路促進(jìn)來源于肺腺癌、包含miR-210的外泌體分泌，并最終證實其在體外實驗中刺激腫瘤血管生成。HSU等[10]發(fā)現(xiàn)了外泌體中的miR-23a 在低氧和正常氧條件下都可促進(jìn)腫瘤血管生成，從而表明缺氧腫瘤癌細(xì)胞和遠(yuǎn)離腫瘤的正常氧環(huán)境中的內(nèi)皮細(xì)胞之間可以傳遞遺傳物質(zhì)。ZHUANG等[11]的研究證明通過激活JAK-STAT信號通路，外泌體中miR-9可以促進(jìn)血管生成。這些結(jié)果表明肺癌來源的外泌體促進(jìn)血管生成，從而可能導(dǎo)致癌癥的發(fā)生和發(fā)展。

1.2外泌體可調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫應(yīng)答 外泌體有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中免疫應(yīng)答的能力，從樹突狀細(xì)胞(DC)釋放的外泌體可攜帶腫瘤抗原，激活免疫應(yīng)答。GUO等[12]的研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)來源于DC細(xì)胞的外泌體與抗癌藥物環(huán)磷酰胺(CTX)、具有促DC細(xì)胞成熟作用的干擾素誘導(dǎo)劑聚肌胞苷酸(poly I:C)聯(lián)合使用能在體內(nèi)和體外實驗中增強(qiáng)抗腫瘤活性。FABBRI等[13]研究表明，來自肺癌細(xì)胞的外泌體miR-21 、 miR-29a可以作為Toll樣受體(TLR)的配體，最終導(dǎo)致腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。因此，作為TLR的旁分泌激動劑，外泌體miRNA可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫應(yīng)答。此外，活化的表達(dá)FasL的CD8+T細(xì)胞分泌的外泌體可激活ERK和NF-κB通路，導(dǎo)致MMP-9表達(dá)增加從而促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移[14]。

1.3外泌體促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT) EMT是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，它賦予細(xì)胞轉(zhuǎn)移和入侵的能力，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。RAHMAN等[15]研究表明，來源于高轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞和晚期肺癌患者血清的外泌體能夠誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞(HBECs)中的波形蛋白表達(dá)和EMT。KIM等[16]研究了EMT中涉及的外泌體內(nèi)容物的變化。在A549人肺腺癌細(xì)胞系中，外泌體的蛋白質(zhì)含量(β-鈣黏蛋白)反映了細(xì)胞表型的變化，miR-23a表達(dá)也顯著增加。

1.4外泌體在肺癌轉(zhuǎn)移中的作用 WANG等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，與NSCLC NCI-H2228細(xì)胞相比，在SCLC NCI-H1688細(xì)胞中觀察到外泌體中TGF-β和IL-10水平升高，在低氧條件下更甚。也發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞分泌的外泌體內(nèi)TGF-β和IL-10表達(dá)升高與肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)。免疫檢查點(diǎn)蛋白是指在免疫系統(tǒng)中存在的一系列抑制信號的分子，含有T細(xì)胞免疫球蛋白和粘蛋白結(jié)構(gòu)域的分子3(Tim-3)是新一代免疫檢查點(diǎn)蛋白，可被其配體Galectin-9激活，從而負(fù)向調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫應(yīng)答。GAO[18]等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)患者血漿內(nèi)的Galectin-9高表達(dá)水平與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。HOSHINO等[19]的研究表明，外泌體整合素α6β4和α6β1與肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)。ZHANG等[20]的一項研究顯示，與健康人相比，NSCLC患者中外泌體lncRNA MALAT-1高表達(dá)。 此外，外泌體MALAT-1高表達(dá)與晚期腫瘤分期和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。這些機(jī)制都可成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。

2 外泌體在肺癌診斷、評估預(yù)后中的作用

外泌體可作為診斷肺癌及評估預(yù)后的新型生物標(biāo)志物。首先，外泌體可反映其親代細(xì)胞的生理狀態(tài)和微環(huán)境，并且大多數(shù)細(xì)胞分泌的外泌體含有特定蛋白質(zhì)、核酸等。其次，外泌體存在于血液和其他體液中，分布廣泛。由于具有磷脂雙分子層，外泌體在細(xì)胞外環(huán)境中非常穩(wěn)定。至今為止，已經(jīng)報道了許多來源于外泌體的miRNA、lncRNA以及蛋白質(zhì)等可作為肺癌潛在的診斷、預(yù)后生物標(biāo)志物。

2.1外泌體miRNA ZHOU等[21]檢測了6種肺腺癌患者外周血中提取的外泌體miRNA(miR-19b-3p、miR-21-5p、miR-221-3p、miR-409-3p、miR-425-5p和miR-584-5p)。其中，miR-19-3p、miR-21-5p和miR-221-3p顯著上調(diào)。此外，LIN等[22]發(fā)現(xiàn)27種來源于肺炎和肺癌的胸腔積液外泌體中差異表達(dá)的miRNA。在這些miRNA中，miR-205-5p和miR-200b在肺癌樣本中顯著上調(diào)，表明這兩種miRNA可能具有鑒別肺癌和肺炎的潛力。上述研究中檢測的外泌體miRNA并未涉及肺癌的早期診斷，因為在這些研究中沒有選擇特定臨床階段的患者。在近期的一項研究中，JIN等[23]對46例Ⅰ期NSCLC患者和42例健康人對照組分離的外泌體進(jìn)行miRNA-seq分析以鑒定NSCLC患者外泌體miRNA的早期診斷價值。發(fā)現(xiàn)了由4個miRNA：let-7b-5p、let-7e-5p、miR-23a-3p和miR-486-5p組成的miRNA診斷小組，可用于診斷Ⅰ期NSCLC，受試者工作特征曲線(ROC)的曲線下面積(AUC)為0.899，靈敏度為80.25%，特異度為92.31%。該課題組還檢測了4種腺癌特異性外泌體miRNA，包括miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p和miR-361-5p，ROC AUC為0.936，靈敏度為80.65%，特異度為91.67%。檢測了3種鱗狀細(xì)胞癌特異性外泌體miRNA：miR-10b-5p、miR -15b-5p和miR-320b，ROC AUC為0.911，靈敏度為83.33%，特異度為90.32%。結(jié)果顯示，這兩個組合具有區(qū)分NSCLC患者腺癌或鱗癌的潛力，這一研究說明外泌體源性miRNA不僅可應(yīng)用于肺癌分期，還可用于判斷肺癌分型。此外，GRIMOLIZZI等[24]學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，miR-126在晚期患者的血漿中水平下調(diào)；還發(fā)現(xiàn)來源于細(xì)胞的外泌體miR-126能夠誘導(dǎo)正常人支氣管上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，而相反，來源于人支氣管上皮細(xì)胞中的外泌體miR-126能夠抑制細(xì)胞生長且誘導(dǎo)惡性缺失。這表明外泌體miRNA在調(diào)節(jié)微環(huán)境中有重要作用，其作為診斷標(biāo)志物在個性化治療領(lǐng)域有廣闊前景。

2.2外泌體蛋白質(zhì) 外泌體中除了miRNA外，還存在多種蛋白質(zhì)，外泌體蛋白質(zhì)也可以作為診斷標(biāo)志物。SANDFELD-PAULSEN等[25]研究了49種外泌體膜附著蛋白在336例肺癌患者和127例健康對照中的診斷潛力。發(fā)現(xiàn)CD151、CD171和tetraspanin 8是可以明顯區(qū)分肺癌患者和非肺癌患者的生物標(biāo)志物。此外，研究者也使用276例NSCLC患者的血清樣本評估了49種蛋白質(zhì)作為預(yù)后標(biāo)志物的潛力。他們發(fā)現(xiàn)5種蛋白質(zhì)(NY-ESO-1、EGFR、PLAP、EpCam和Alix)對預(yù)測肺癌患者長期生存率有效，可以作為肺癌潛在的預(yù)后標(biāo)志物。除了血液，研究人員還發(fā)現(xiàn)了來自其他體液的外泌體蛋白：富含亮氨酸的α-2-糖蛋白(LRG1)與蛋白質(zhì)相互作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附等過程密切相關(guān)，在NSCLC患者組尿液和組織外泌體中表達(dá)水平高于健康組。因此，除血清外，尿液外泌體也可能成為檢測肺癌的潛在標(biāo)志物[26]。PARK等[27]從NSCLC患者的惡性胸腔積液中分離出高純度的外泌體，并發(fā)現(xiàn)了潛在的診斷標(biāo)志物：EGFR、K-ras、basigin、癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子6、claudin1、claudin3和RAB家族蛋白。

2.3其余外泌體內(nèi)含物 除了miRNA、蛋白質(zhì)以外，外泌體中還含有其他分子，如長鏈非編碼RNA(lncRNAs)、環(huán)狀RNA(circRNA)。ZHANG等[20]的一項研究顯示，與健康人相比，NSCLC患者外泌體長鏈非編碼RNA(lncRNA) MALAT-1高表達(dá)。此外，LI等[28]的研究結(jié)果表明，環(huán)狀RNA(circRNA)在血清外泌體中含量多并且穩(wěn)定。外泌體血清circRNAs可以區(qū)分結(jié)腸癌患者和健康人。這些結(jié)果表明，外泌體circRNA、外泌體lncRNA有望成為診斷癌癥的生物標(biāo)志物。

3 外泌體在肺癌治療中的作用

3.1外泌體作為藥物遞送載體 外泌體作為藥物遞送載體具有多個優(yōu)點(diǎn)，如外泌體的磷脂雙分子層可防止藥物在短時間內(nèi)降解，具有穩(wěn)定性，并且利于外泌體與靶細(xì)胞膜直接融合；外泌體具有較低的免疫原性和毒性；外泌體由特定細(xì)胞釋放，可作為細(xì)胞間傳遞信號的載體。有研究已經(jīng)報道外泌體可作為天然的藥物遞送載體：SRIVASTAVA等[29]研發(fā)了一種含有阿霉素的外泌體遞送系統(tǒng)，并證明了這一系統(tǒng)對H1299和A549肺癌細(xì)胞系具有抗癌活性。紫杉醇(PTX)是一種具有抗癌活性的二萜生物堿類化合物，有研究者將巨噬細(xì)胞衍生的外泌體包裹紫杉醇制成外泌體制劑(exoPTX)，表面修飾氨基乙酰胺聚乙二醇(AA-PEG)。可通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用在肺癌細(xì)胞中積累，其藥物水平高于運(yùn)用非外泌體包裹的水平。即使用工程化的巨噬細(xì)胞外泌體進(jìn)行靶向紫杉醇藥物遞送可增強(qiáng)肺癌轉(zhuǎn)移的治療效果[30]。但要使用外泌體作為藥物遞送載體尚存在一些問題，例如，如何在不破壞外泌體結(jié)構(gòu)的條件下將藥物載入外泌體內(nèi)；如何控制外泌體藥物的釋放，提高藥物傳遞效率等。

3.2外泌體改變藥物敏感性的作用 眾多研究團(tuán)隊報道了耐藥性與多種因素相關(guān)，外泌體可能為潛在的機(jī)制。一些研究已經(jīng)報道了外泌體對肺癌藥物[順鉑和表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)]和放射療法耐藥性的影響。LI等[31]發(fā)現(xiàn)來源于吉非替尼處理的細(xì)胞外泌體降低了順鉑的敏感性，而源自順鉑處理過的細(xì)胞的外泌體沒有改變吉非替尼的敏感性。如果加入GW4869(一種外泌體分泌抑制劑)，則可觀察到順鉑和吉非替尼具有協(xié)同作用。這些結(jié)果表明，抑制外泌體的分泌可以降低EGFR-TKIs與化療藥物之間的拮抗作用，提高藥物敏感性。另一項研究報道了外泌體內(nèi)中間變性淋巴瘤激酶(ALK)對ALK抑制劑色瑞替尼(Ceritinib)敏感性的降低作用[32]，作者觀察到內(nèi)含ALK外泌體的處理組能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞生長加快以及色瑞替尼敏感性降低，表明外泌體中ALK蛋白是促進(jìn)腫瘤生長以及損害ALK抑制劑(色瑞替尼)對ALK陽性的非小細(xì)胞肺癌治療效果的關(guān)鍵因素。腫瘤耐藥受多種因素調(diào)控，外泌體由于包含核酸、蛋白等物質(zhì)，在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮重要作用，而腫瘤利用了這種通訊機(jī)制從而改變藥物的敏感性。

4 小 結(jié)

外泌體是內(nèi)含核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等的細(xì)胞外囊泡，在許多生理與病理過程中發(fā)揮重要作用，并且能將信號分子傳遞給其他細(xì)胞從而改變其他細(xì)胞的功能，是細(xì)胞間信息傳遞的重要方式。越來越多的研究顯示其可以在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用，檢測外泌體內(nèi)容物有助于肺癌的診斷、治療與預(yù)后評估。但有關(guān)外泌體如何形成、其發(fā)揮作用的功能機(jī)制以及靶分子和信號通路的研究尚未完全清楚。此外，目前有關(guān)外泌體檢測的分離、純化、定量等步驟尚沒有標(biāo)準(zhǔn)化方法，所以仍需對外泌體進(jìn)行更加深入的探索，更好地闡明外泌體在肺癌中的作用機(jī)制，利用外泌體研發(fā)出更多有效的治療、診斷方法，為肺癌的診斷、治療提供新思路。