基因芯片技術對結核分枝桿菌利福平及異煙肼的耐藥性檢測研究

孫桂英，趙 剛，沈 燕，徐密琴，高勝利，俞 凈,鈕志林

(蘇州市吳江區第一人民醫院感染科，江蘇蘇州 215200)

結核病是因感染結核分枝桿菌(Mtb)而發生的并具有傳染性的慢性疾病，可累及全身各種器官，最為常見是以肺部受累形成的肺結核病。根據WHO的2016年結核病年度報告顯示[1]，肺結核病在2015年的全球新發病例高達1 040萬例，死亡病例為140萬例，超過HIV；同年我國新發生肺結核病91萬例，僅次于印度(238萬例)與印尼(102萬例)位列全球第3位，死亡病例約3.5萬。當前,我國是全球22個結核病高負擔國家及27個耐多藥(MDR)結核病高負擔國家之一[2]。自1993年WHO宣布“全球結核病緊急狀態”以來，多個國家及地區陸續出現了1例或多例MDR結核病。全球有3.9%的新發病例和21%的復診患者患有MDR結核病[1]。結核病耐藥已成為全世界結核病疫情控制的巨大阻礙。建立有效且快速的Mtb耐藥檢測方法對臨床合理用藥及結核病疫情控制意義重大。長期以來，傳統羅氏比例法由于操作簡單、經濟、方便、易于推廣等因素而被廣泛應用于Mtb藥敏試驗，并被視為結核病診斷的“金標準”。但該方法耗時較久，步驟繁瑣，已很難滿足當前對MDR結核病診斷及時性的需求。伴隨著Mtb耐藥分子機制的闡明，幾種快速檢測結核病耐藥的分子藥敏檢測技術得以問世，其中基因芯片技術日益受到重視。與此同時，近年來受耐藥率不斷升高的影響，利福平(RFP)與異煙肼(INH)這一經典的抗結核病一線藥物組合在蘇州吳江地區的治療效果有所降低。本研究采用基因芯片技術對Mtb的耐藥性進行檢測，并與傳統羅氏比例法藥敏試驗結果進行對比，同時采用DNA測序驗證，旨在探討基因芯片法對蘇州地區Mtb臨床分離株RFP與INH耐藥性快速檢測的實用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年5月1日至2018年12月31日在蘇州市吳江區第一人民醫院感染科發現的痰液標本涂片陽性的結核病患者。以無菌容器連續3 d采集所有患者的第1口晨痰2～5 mL并及時送檢。

1.2試劑與儀器 晶芯?系列試劑或儀器均購自博奧生物公司，包括核酸快速提取儀(ExtractorTM 36)、芯片洗干儀(SlideWasherTM 8)、芯片雜交儀(BioMixerTM Ⅱ)、微陣列芯片掃描儀(LuxScanTM10K-B)、Mtb耐藥基因檢測試劑盒與菌種鑒定試劑盒；實時PCR擴增儀(美國伯樂)，改良羅氏培養基(海博生物)，PNB與TCH菌種鑒定培養基。

1.3方法

1.3.1羅氏培養藥敏試驗 嚴格按照《結核病診斷實驗室檢驗規程》[3]進行試驗操作。采用2倍于痰標本量的標本消化液進行樣本前處理，接種至改良羅氏培養基后進行恒溫(37 ℃)培養，觀察到陽性培養結果后即行比例法藥敏試驗及菌種鑒定，陰性培養結果延長培養時間，最長不超過8周。將臨床分離Mtb的初生長2周菌落研磨并配成菌懸液，濃度1 mg/mL，梯度稀釋，目標濃度分別為10-2mg/mL與10-4mg/mL，分別滿環沾取并接種至含RFP(40 μg/mL)與INH(0.2 μg/mL)的藥敏試驗培養基，同時采用PNB與TCH培養基鑒定菌種。所有樣本完成以上處理后均進行恒溫(37 ℃)培養，4周后觀察結果。本研究以Mtb標準菌株H37RV為質控菌株。

1.3.2基因芯片檢測 選擇RFP耐藥基因rpoB及INH耐藥基因katG與inhA作為本次檢測的目標基因，檢測Mtb中以上基因啟動子的野生型(wt)及多種突變型(mt)，具體實驗操作嚴格按照試劑盒說明書及實驗室操作標準程序進行。(1)采用核酸快速提取儀進行核酸提取；(2)在提取好核酸的離心管中加入PCR擴增試劑進行PCR擴增；(3)在PCR擴增反應結束后對標本進行芯片雜交，擴增產物按說明書加雜交緩沖液加入芯片，放入56 ℃水浴箱2 h；(4)芯片雜交結束后，將芯片按照說明書所配置好的洗滌液進行洗滌，洗滌后進行干燥；(5)采用微陣列芯片掃描儀對干燥后芯片進行掃描，軟件讀取信號并自行判讀結果。

1.3.3DNA測序驗證 對經羅氏比例法檢測的Mtb陽性菌株，進行3個目標基因耐藥相關區域擴增產物的DNA測序，具體測序工作由博奧生物公司完成，采用第一代DNA測序技術雙脫氧鏈終止法進行核酸測序。

1.4統計學處理 采用SPSS統計學軟件進行數據分析，對配對計數資料進行交叉制表下的χ2檢驗分析兩種檢驗方式是否存在差異，P<0.05為差異有統計學意義；采用Kappa檢驗分析兩種檢驗方法的結果一致性，Kappa≥0.75為一致性良好。

2 結 果

2.1標本檢測情況 本研究共納入300例痰液涂片陽性肺結核患者的共計900份痰標本，排除31份(3.44%)培養陰性及7份(0.78%)培養污染標本后對862份標本進行了藥敏試驗與菌種鑒定。862份標本中有4份(0.46%)藥敏試驗失敗，5份(0.58%)菌種鑒定為非結核分枝桿菌(NTM)，最終有853份可用于藥敏分析。900份痰標本中，基因芯片檢測未檢測到Mtb的有11份(1.22%),NTM9份(1.00%)，結果不能判定的有17份(1.89%)，最終有863份可用于藥敏分析。綜合藥敏試驗與基因芯片檢測結果，最終有829份標本的檢測結果可用于藥敏檢測結果的比較。

表1 基因芯片檢測Mtb RFP和INH耐藥相關突變位點情況

注：密碼子改變一欄中的數字前后字母分別為wt與mt堿基

2.2基因芯片檢測Mtb耐藥基因相關突變位點 基因芯片檢出rpoB突變型菌株109株，包括單一位點突變108株與雙位點突變1株。突變頻率最高的2個位點分別為531位點[56.88%(62/109)]與526位點[23.85%(26/109)]。基因芯片檢出katG/inhA突變型菌株162株，包括katG315單一位點突變112株[69.14%(112/162)]，inhA-15單一位點突變47株[29.01%(47/162)]，katG315位點與inhA啟動子區域雙突變3株[1.85%(3/162)]。見表1。

表2 基因芯片與羅氏比例法檢測RFP、INH及MDR的結果比較(n)

2.3基因芯片與羅氏比例法檢測RFP、INH及MDR 基因芯片與羅氏比例法檢測RFP耐藥及MDR的效果相近(均P>0.05)，對INH耐藥的檢測差異有統計學意義(P<0.05)，見表2；以羅氏比例法為金標準，對基因芯片檢測RFP、INH耐藥及MDR的評估見表3。

表3 基因芯片檢測RFP、INH及MDR的效果評價

注：本研究中，將對RFP與INH均耐藥定義為MDR

2.4基因芯片技術與DNA測序的對比 以DNA測序結果作為金標準，基因芯片檢測RFP耐藥結果不一致為4株，檢測準確率為99.52%(825/829)；檢測INH耐藥結果不一致為2株，檢測準確率為99.76%(827/829)，相關分離菌株檢測結果的不一致基因位點見表4。

表4 基因芯片技術與DNA測序結果對比

3 討 論

隨著全程督導化學治療策略的逐步開展，我國個別地區結核病疫情開始有所緩解，但全國總體形式嚴峻依舊，區域化流行趨勢差別仍然存在[4]。鑒于本院所屬蘇州吳江地區的RFP與INH耐藥結核病病例逐年增多的趨勢明顯，尋求一種及時、準確的耐藥性檢測方法對有效控制本地區耐多藥結核病的流行與傳播具有重要的現實意義。與傳統方法相比，生物芯片技術具有快速、結果可靠、重復性好、通量高、可以在一個反應中檢測成千基因表達的特點，為Mtb的實驗室診斷開拓了新的途徑，更滿足了當前臨床快速檢測之需求[5]。

研究表明[6-7]，95%以上的RFP耐藥與rpoB基因變異有關。本研究選擇了幾種rpoB基因常見突變位點(511、513、516、526、531、533位點)，考察與蘇州吳江地區RFP耐藥的相關性。基因芯片檢測結果表明，本地區RFP耐藥基因rpoB的突變類型包括511(T→C)、513(A→C或C→A)、516(G→T或A→G或A→T)、526(A→G或A→T或C→G或C→T)、531(C→T或C→G)、533(T→C)等單位點突變以及511與516的雙位點突變，其中的531(C→T或C→G)與526(A→G或A→T或C→G或C→T)為主要突變類型，突變率分別為56.88%與23.85%。KatG基因315位點突變與inhA基因-15位點突變不僅普遍存在于耐藥Mtb中，同時也與INH耐藥高度相關。基因芯片檢測結果表明，本地區INH耐藥基因的主要突變類型為KatG315(G→A或G→C)，突變率達69.14%，與吉林省(68.55%)[8]相似，但與青島(44.83%)[9]及青海(75.5%)[10]等地區明顯不同，提示KatG315突變存在一定地域差異。后經DNA測序驗證，基因芯片檢測RFP與INH耐藥相關基因突變位點不一致分別為4株與2株，檢測準確率分別為99.52%與99.76%。表明本次采用基因芯片檢測Mtb RFP和INH耐藥相關突變位點的結果是可靠的，總體提示rpoB531、526位點突變及katG315位點突變可能是促成蘇州吳江地區RFP和INH耐藥病例增多最為關鍵的分子機制。

本研究中，基因芯片與羅氏比例法藥敏試驗檢測RFP耐藥及MDR效果相近，對INH耐藥的檢測結果存在明顯差異，由于羅氏比例法藥敏試驗為金標準，故初步認為基因芯片對INH耐藥檢測的一致性可能不及RFP與MDR。具體效果：以羅氏比例法為金標準，基因芯片檢測RFP耐藥的符合率為97.47%，靈敏度為94.90%，特異度為97.81%，陽性預測值為85.32%，陰性預測值為99.31%，Kappa值為0.952；檢測INH耐藥的符合率為94.45%，靈敏度為78.16%，特異度為99.84%，陽性預測值為99.38%，陰性預測值為93.25%，Kappa值為0.823；檢測MDR的符合率為97.83%，靈敏度為82.50%，特異度為99.47%，陽性預測值為94.29%，陰性預測值為98.16%，Kappa值為0.927。由此可見，基因芯片檢測RFP耐藥及MDR的效果是值得肯定的，但檢測INH耐藥的符合率、靈敏度、陰性預測值以及Kappa值均相對偏低，其中靈敏度明顯偏低，Kappa值低也進一步印證了其與金標準檢測一致性存在一定不足。分析原因可能包括以下幾方面：(1)非基因突變的原發性耐藥造成對INH的耐藥性，現已探明的機制為多層Mtb胞外包被與活性多藥外排離子泵構成了屏障機制，繼而對藥物運輸產生干擾[11-12]；(2)非KatG與inhA基因(如ahpC、KasA、ndh等)的突變也與INH耐藥具有一定相關性[13]；(3)KatG與inhA基因中除本研究選擇315及-15位點的極少數其他位點突變也可能引起INH耐藥[14-15]。但總體來看，74.52%的靈敏度尚在可接受范圍，同時基于檢測的及時性優勢，筆者認為基因芯片在蘇州吳江地區臨床INH耐藥菌株的快速診斷價值不應被忽視。

綜上所述，rpoB531、526位點突變與katG315位點突變可能是蘇州吳江地區Mtb產生RFP和INH耐藥的關鍵性分子機制，基因芯片技術能快速且高準確度地檢測出以上位點的突變情況，值得在本地區推廣應用于RFP和INH的耐藥性檢測。但基因芯片技術尚不能檢出所有的基因突變位點，本研究中其對INH耐藥的靈敏度相對偏低，提示現階段該技術還必然存在某些局限，但可作為傳統藥敏試驗的重要補充。本課題組擬在后續研究中酌情增加相關基因位點進行檢測，以期進一步提高本地區對RFP和INH耐藥性檢測的敏感度。